HPLC-PDA法測定明日葉不同部位中的4-羥基德里辛和黃色當歸醇含量

作者單位：

• 上海海洋大學食品學院，上海
• 上海市園林科學研究所，上海
• 宜賓學院化學與化工學院，四川 宜賓
• 上海交通大學農業與生物學院，上海

摘     要

採用高效液相色譜配備光電二極管陣列檢測器法測定明日葉根、莖和葉中4 – 羥基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）和黃色當歸醇（xanthoangelol，XAG）的含量。樣品分析選用Halo C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），流動相為0.1%甲酸（A）-甲醇（B）溶液，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，檢測波長為370 nm，柱溫為40 ℃。4-HD、XAG在0.945～18.900、1.048～20.960 μg/mL質量濃度範圍內線性關係良好，樣品含量的相對標準偏差分別為3.13%、2.52%，方法的重復性好，平均回收率分別為103.70%、103.05%。

經檢測明日葉中4-HD的分布規律為：莖（149.16 μg/g）＞根（122.42 μg/g）＞葉（1.24 μg/g）；XAG的分布規律為：根（144.28 μg/g）＞莖（75.17 μg/g）＞葉（1.21 μg/g）。4-HD和XAG在根和莖中的分布顯著高於其在葉中的分布。

關鍵詞：明日葉；4-羥基德里辛；黃色當歸醇；高效液相色譜配備光電二極管陣列檢測器

英文摘要（Abstract）

Determination of 4-Hydroxyderricin and Xanthoangelol in Different Parts of Angelica keiskei by HPLC-PDA

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;Shanghai Institute of Landscape Gardening Science, Shanghai 200232, China;College of Chemistry and Chemical Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China;School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Abstract: In this study, the contents of 4-hydroxyderricin (4-HD) and xanthoangelol (XAG) in roots, stems and leaves of Angelica keiskei were determined using high performance liquid chromatography with photo-diode array (HPLC-PDA) detector. The samples were separated on a Halo C18-column (4.6 mm × 150 mm, 2.7 μm), gradiently eluted with 0.1% formic acid in water (A) and methanol (B) at a flow rate of 0.3 mL/min and detected at 370 nm. The column temperature was set at 40 ℃. Good linear relationships between peak area and injection amount of 4-HD and XAG were established within the range of 0.945–18.900 and 1.048–20.960 μg/mL, respectively. The relative standard deviations (RSDs) of peak area for the two compounds were 3.13% and 2.52%, respectively, suggesting good reproducibility of the developed method. The average recoveries of the spiked compounds were 103.70%, and 103.05%, respectively.

The results showed that the distribution of 4-HD in different parts of Angelica keiskei was ranked in decreasing order as follows: stems (149.16 μg/g) > roots (122.42 μg/g) > leaves (1.24 μg/g), while the order of XAG content was as follows: roots (144.28 μg/g) > stems (75.17 μg/g) > leaves (1.21 μg/g). The contents of 4-HD and XAG in roots and stems of Angelica keiskei were significantly higher than in leaves.

Key words: Angelica keiskei; 4-hydroxyderricin (4-HD); xanthoangelol (XAG); high performance liquid chromatography

with photo-diode array (HPLC-PDA)

 

明日葉（Angelica keiskei）是原產於日本伊豆、八丈島的一種藥食兼用的蔬菜，屬水芹科多年生草本植物，因今日採摘明日即可發芽而得名[1-3]。

20世紀90年代從日本引進我國，現在逐步發展擴大。明日葉中含有20多種具有生理活性的查爾酮、香豆素類、黃酮類物質，其中4-羥基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）和黃色當歸醇（xanthoangelol，XAG）是明日葉中以苷元形式存在的重要的查爾酮類物質[4-5]，具有特殊的抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗血栓等多種生物活性和藥用價值，在植物中非常罕見，其化學結構式如圖1所示[6-8]。

植物中不同次生代謝產物的分布和積累是有差異的，瞭解植物體內有效成分含量的分布對藥用植物的栽培、採收及開發可以提供指導[9]。然而目前關於明日葉中活性成分4-HD和XAG在明日葉中不同部位（根、莖和葉）的含量差異分析鮮見報道。

本實驗採用高效液相色譜配備光電二極管陣列（high performance liquid chromatography with photo-diode array，HPLC-PDA）法測定明日葉根、莖、葉3 個部位中4-HD和XAG的含量，為明日葉的開發和利用提供數據基礎[10-11]。

 

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明日葉，採自上海交通大學七寶校區明日葉種植基地，採集時間為2014年11月。樣品分裝後在－20 ℃條件下保存。

4-HD和XAG標準品（純度均大於98%） 中國科學院上海藥物研究所天然產物化學研究室；甲醇（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；其他溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HPLC儀（PDA檢測器及Chromquest色譜工作檢測站） 美國Thermo Fisher Surveyor公司；Scout-SE型電子天平 奧豪斯儀器常州有限公司；DHG-9140A型電熱恆溫鼓風乾燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；BCD-189JB-S型冰箱 上海夏普電器有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器 崑山市超聲儀器有限公司；HH-S型數顯恆溫水浴鍋 金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠；TGL-16M高速台式離心機 上海盧湘儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍乾燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；HK-02A型100 g手提式粉粹機 廣州旭朗機械設備有限公司；RE-52C型旋轉蒸發器水浴槽 上海青浦滬西儀器廠；DC-2006型低溫恆溫槽 上海比朗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備

準確稱取4-HD、XAG各0.945、1.048 mg，分別置於5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超聲溶解得對照品儲備液。各吸取1 mL對照品儲備液，配成混合對照品儲備液。分別準確吸取混合對照品儲備液200、150、100、50、10 μL置於1 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，配製成一系列混合對照品工作溶液[12]。

1.3.2 供試品溶液制備

明日葉清洗乾淨，剪切分為葉子、莖乾、樹根3 個部分，置於－4 ℃條件下冷凍24 h，然後真空冷凍乾燥22 h，粉碎，過100 目篩[13-14]，得到乾燥粉末。按1∶10（g/mL）將樣品粉末與體積分數50%乙醇溶液混合，37 ℃水浴加熱浸取3 h，冷卻到室溫，收集乙醇浸取液，按上述方法再浸取樣品一次，合併的乙醇浸取液減壓回收，至無醇味得到流浸膏。加入8 倍流浸膏質量的去離子水，乙酸乙酯萃取水溶液中目標物質，直至乙酸乙酯萃取液近於無色。合併乙酸乙酯溶液於圓底燒瓶中，在31 ℃、0.1 MPa條件下進行旋轉蒸發去除乙酸乙酯，即得樣品粗品，保存備用[15-18]。

用甲醇將適量的樣品粗品定容至1 mL，超聲混勻，過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.3 色譜條件

Halo C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序如下：0～2 min，30% A；2～40 min，30～0% A；40～45 min，0% A；45.0～45.1 min，0～30% A；45.1～50.0 min，30% A。流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長370 nm；進樣量5 μL；檢測時間50 min。

1.3.4 HPLC-PDA方法學考察

1.3.4.1 精密度實驗

精密吸取混合對照品工作溶液（C4-HD=9.45 μg/mL、CXAG=10.48 μg/mL）5 μL，重復進樣5 次，分別得到5 個峰面積，進行精密度實驗測定。

1.3.4.2 重復性實驗

取樣品6 份，照1.3.2節方法平行制備，分別進樣測定，計算重復性。

1.3.4.3 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的樣品適量共5 份， 分別加入混合對照品儲備液（C4-HD=94.5 μg/mL、CXAG=104.8 μg/mL）100 μL，按供試品溶液的測定方法處理，測定峰面積，分別計算加樣回收率。

1.3.5 樣品含量測定

根據4-HD和XAG的HPLC色譜峰面積，依據下式分別可以算出樣品中4-HD和XAG的含量。

式中：A為4-HD或XAG的含量/（μg/g）；C樣為根據標準曲線得出的被測樣品中4-HD或XAG的質量濃度/（μg/mL）；V定為樣品最終定容體積/mL；M為試樣質量/g；F為稀釋倍數。

 

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

對4-HD和XAG的混合對照品儲備液在HPLC-PDA中進行分離並且掃描，在波長370 nm處有最大吸收顯示，故本實驗以370 nm作為掃描波長。

2.2 樣品溶劑的選擇

提取溶劑一般有甲醇、乙醇、正己烷等，但是甲醇、正己烷等對人體有害。乙醇可有效降低查爾酮酶的活性[19-21]，故選擇體積分數50%乙醇溶液作為第1步的萃取劑。根據水沈原理，利用體積分數50%乙醇溶液，可減少提取液中澱粉、蛋白質、黏質等成分的浸入，回收

乙醇後，加水靜置處理，可除去溶液中的樹脂、脂溶性色素，除去雜質及沈澱[22]。目標物的極性較小，根據相似相容原理，故用乙酸乙酯從溶液中萃取目標物[23]。

2.3 HPLC-PDA方法學考察結果

按照1.3.4節實驗方法測定，分別可得4-HD峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.85%，XAG峰面積的RSD為0.93%，表明該方法精密度良好；4-HD含量的RSD為3.13%，XAG含量的RSD為2.52%，表明重復性良好；4-HD的平均回收率為103.70%，XAG的平均回收率為103.05%，RSD均小於2%。說明本實驗中的HPLC-PDA方法完全適用於樣品的測定。

2.4 線性關係分析

將1.3.1節制備的一系列混合對照品工作溶液，在1.3.3節所述色譜條件下進行峰面積測定，以質量濃度C（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積S為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，繪制標準品的標準曲線。4-HD的回歸方程為Y=305 439X＋1 417 954，R2=0.999 2；XAG的回歸方程為Y=288 515X＋1 492 839，R2=0.999 3。

結果表明4-HD、XAG在0.945～18.900、1.048～20.960 μg/mL質量濃度範圍內線性關係良好。混合對照品工作溶液（C4-HD=9.450 μg/mL、CXAG=10.480 μg/mL）色譜圖見圖2，4-HD和XAG 2 個峰之間的分離度為1.8，表明本實驗的色譜條件完全適用於4-HD和XAG的分離和檢測，且分離效果良好。

圖 2   混合對照品工作溶液HPLC色譜圖

Fig.2   HPLC chromatogram of standard mixture

2.5 樣品中4-HD和XAG的含量測定

按1.3.3節所述色譜條件進行供試品溶液的測定，在波長370 nm處記錄明日根、莖、葉的HPLC圖，見圖3。

（A.明日葉根提取物；B.明日葉莖提取物；C.明日葉葉提取物）

圖 3   明日葉樣品HPLC色譜圖

Fig.3   HPLC chromatograms of Angelica keiskei extracts

 

計算樣品中4-HD和XAG含量，並對含量進行對比分析，明日葉不同部位中4-HD和XAG的含量測定結果見表1。

表 1 明日葉不同部位中4-HD和XAG的含量 Table 1 Contents of 4-HD and XAG in different parts of Angelica keiskei
部位	4-HD含量/（μg/g）	XAG含量/（μg/g）
葉	1.24±0.04	1.21±0.03
莖	149.16±3.94	75.17±2.12
根	122.42±3.84	144.28±3.56

 

2.6 不同部位4-HD和XAG含量比較

明日葉各部位均含有4-HD和XAG，且各部位之間差異較大，4-HD主要分布在莖中。明日葉各部位4-HD的含量依次為：莖（149.16 μg/g）＞根（122.42 μg/g）＞葉（1.24 μg/g）。根、莖與葉這3 個部位之間4-HD的含量差異顯著。莖中4-HD的含量最高，是根、葉含量的1.2～120.3 倍。

明日葉中X A G 含量的分布規律依次為： 根（144.28 μg/g）＞莖（75.17 μg/g）＞葉（1.21 μg/g），和4-HD的分布特點有所不同。根、莖、葉這3 個部位之間含量差異更明顯，尤其根中XAG含量最高，是莖、葉的1.9～119.2 倍。

這3 個部位中，根和莖乾中的4-HD和XAG的含量顯著大於葉中的含量，莖乾中4-HD（149.16 μg/g）的含量與根中（122.42 μg/g）的含量差值為26.74 μg/g，遠小於明日葉根中XAG（144.28 μg/g）的含量與莖乾（75.17 μg/g）的差值69.11 μg/g。且明日葉根中4-HD和XAG的含量都比較高，故從經濟實際角度考慮，明日葉根比莖乾在提取、利用4-HD和XAG方面更具有利用價值。

 

3 結 論

本實驗在流動相為體積分數0.1%甲酸溶液和甲醇溶液，梯度洗脫、流速為0.3 mL/min、檢測波長為370 nm、柱溫為40 ℃的HPLC條件下，考察了明日葉植株不同部位（根、莖和葉）中4-HD和XAG含量分布情況。4-HD和XAG在明日葉的根部和莖部分含量較高，而其在葉片部分含量很低。

4-HD在莖部的含量大於根部，但兩者之間的差異性不大，XAG在根部的含量明顯大於其莖部，相比而言，根中4-HD和XAG這2 種物質含量都較高，更有實際利用價值。這表明明日葉植株不同部位的4-HD和XAG的代謝累積不均勻，具有部位選擇性。該研究將對明日葉的不同部位合理開發利用提供理論依據。

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