明日葉查爾酮對小鼠肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響

摘  要

目的：

研究明日葉查爾酮（Ashitabechalcone，AC）對小鼠H22肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響。

方法：

將50只荷H22肝癌小鼠隨機分為AC不同劑量實驗組（5、20、40mg/kg），陰性對照組和環磷酞胺（cytoxan，CTX）陽性對照組，共5組，每組10只。AC實驗組小鼠每天分別按不同的劑量灌胃，陰性對照組小鼠給予生理鹽水灌胃，CTX組隔天腹腔注射CTX20mg/kg，10d後處死小鼠，取瘤組織測定瘤質量、抑瘤率，並採用免疫組化法檢測各組小鼠腫瘤細胞Caspase-3和Bax蛋白的表達，用MTT法檢測各組小鼠腫瘤細胞增殖活性。

結果：

陰性對照組小鼠腫瘤細胞Caspase-3和Bax陽性細胞表達率分別為5.00%和4.68%，AC40mg/kg劑量組分別為38.52%和35.76%，均高於陰性對照組（P<0.05）；陰性對照組肝癌細胞增殖活性為1.135±0.032，AC40mg/kg劑量組為0.716±0.018，低於陰性對照組（P<0.05）。AC20、40mg/kg劑量組平均瘤質量均明顯低於陰性對照組（P<0.05）。

結論：

明日葉查爾酮可上調Caspase-3和Bax蛋白的表達且具有抑制腫瘤細胞增殖作用。

關鍵詞：

明日葉查爾酮，肝癌，Caspase-3，Bax

研究地點：

青島大學醫學院

 

明日葉（Ashitaba）是一種野生芹科植物，原產於日本八丈諸島，因其生命力頑強，今日摘葉明日可發新芽，故稱明日葉。據報道，該植物具有提高機體免疫力、改善睡眠、延緩衰老等多重功效。

有研究證明，明日葉的主要效應成分查爾酮（chalcone），在抗腫瘤、抗氧化等方面作用顯著。細胞凋亡與腫瘤的發生發展有非常密切的關係，細胞凋亡減少是腫瘤發生發展的重要因素。Caspase-3是凋亡執行的重要效應分子，Bax是重要的促凋亡蛋白，二者在細胞凋亡的過程中起著關鍵作用。但目前尚未見明日葉查爾酮對腫瘤細胞Caspase-3和Bax蛋白表達影響方面的研究報道。

本實驗採用H22肝癌荷瘤小鼠，通過飼以不同劑量的明日葉查爾酮（Ashitabachalcone，AC），用免疫組化法檢測小鼠腫瘤細胞Caspase-3和Bax的表達情況，用MTT法檢測小鼠腫瘤細胞增殖活性等，觀察AC的抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1動物和材料

H22肝癌荷瘤種鼠由山東省實驗動物中心提供。清潔級健康昆明小鼠50只（雌雄各半），由山東魯抗醫藥實驗中心提供，6~8周齡，體質量18~20g。小鼠實驗前於本實驗室適應性餵養7天。明日葉查爾酮由本實驗室制備，經紫外分光光度法測定其純度>90%。查爾酮標準品購於美國Sigma公司，純度＞99%。RPMI1640培養基、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍（MTT）均購自美國Gibc。公司；環磷酞胺（cytoxan，CTX）購於江蘇恆瑞醫藥股份有限公司；Caspase-3，Bax、一抗、二抗和即用型SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。5%二氧化碳培養箱，日本三洋電器有限公司產品；TDL-5離心機，上海安亭科學儀器廠產品；瑞典產R。sysAnth。s2010型雙波長酶標儀；日本產。lympusXDS-1B型倒置顯微鏡；電子天平，上海天平儀器廠產品。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理

無菌抽取H22肝癌小鼠腹水，鏡下調節腫瘤細胞密度至1×10⁷/ml，製成細胞懸液於小鼠右前肢腋窩處皮下接種，每只0.2ml。腫瘤細胞接種後次日，將50只小鼠隨機分為陰性對照組、環磷酞胺組和AC不同劑量實驗組（5、20、40mg/kg），每組10只，雌雄各半。3個AC實驗組分別經口灌胃給予不同濃度的AC，連續10天。陰性對照組同法給予生理鹽水，環磷酞胺組隔日腹腔注射CTX1次（20mg/kg）。於第11天頸椎脫臼處死小鼠，取瘤組織待檢。

1.2.2瘤細胞中Caspase-3和Bax蛋白表達的檢測

採用SABC免疫組化法，按檢測試劑盒說明操作。將瘤組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，3%H₂0₂消除內源性過氧化物酶，微波修復抗原。按1：50濃度滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，脫水，透明和封片。顯微鏡下觀察Caspase-3和Bax蛋白的表達水平。Caspase-3陽性表達細胞為細胞胞漿中出現棕黃色或褐色顆粒。Bax主要在胞漿表達，呈現棕黃色或褐色顆粒的細胞為陽性表達細胞。每只動物觀察500個細胞，計數其中有陽性表達的細胞。按下式計算陽性表達率：

陽性表達率=〔陽性細胞數葉數細胞總數）x100%

1.2.3瘤細胞增殖活性測定

將瘤組織剪碎研磨，經過濾、離心後製成瘤細胞懸液。調節細胞密度為1×10⁶/ml，接種於96孔培養板，每孔100ul，置於5%二氧化碳培養箱中37℃培養16h。用MTT法測定各孔吸光度，各組腫瘤細胞增殖活性用平均吸光度D（490）值表示，並按下列公式計算各組小鼠肝癌細胞增殖活性的抑制率：

抑制率=〔陰性對照組D（490）值－實驗組D（490）值〕/陰性對照組D（490）值x100%

1.2.4瘤質量和抑瘤率

用電子天平稱量每只動物瘤質量，計算各組平均瘤質量，並按下列公式計算抑瘤率：

抑瘤率＝（陰性對照組平均瘤質量－實驗組平均瘤質量）/陰性對照組平均瘤質量x100%

1.3統計學方法

採用SPSS17.0統計軟件處理數據，計數資料採用了檢驗，計量資料用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1Caspase-3和Bax蛋白表達

結果見表1。

陰性對照組陽性表達的細胞數少且顏色淺淡，呈弱表達（圖1A），陽性表達率為5.00%。AC40mg/kg劑量組Caspase-3陽性表達細胞數多且顏色較深，呈強表達（圖1B），其陽性表達率為38.52%，明顯高於陰性對照組（P<0.05）。

陰性對照組Bax陽性表達的細胞少，染色淺（圖2A）。AC40mg/kg組較陰性對照組的陽性表達細胞數多，且染色較深（圖2B）。AC40mg/kg組陽性細胞表達率為35.76%，明顯高於陰性對照組（4.68%）（P<0.05）。

2.2腫瘤細胞增殖活性

各組細胞增殖活性測定結果見表2。AC20、40mg/kg劑量組腫瘤細胞增殖活性分別為0.716±0.018和0.834±0.027，均較陰性對照組顯著降低（P<0.05）。

2.3平均瘤質量和抑瘤率

結果見表3。AC20、40mg/kg劑量組平均瘤質量均顯著低於陰性對照組（P<0.05）。

3討論

明日葉查爾酮屬黃酮類化合物，是明日葉的主要功效成分，其化學結構為1,3-二苯基丙烯酮，是植物體內合成黃酮的前體，以它為母體的天然化合物廣泛存在於植物界中。有研究證明，從甘草中提取的查爾酮具有抗腫瘤、抗氧化等功效，本實驗探討了從明日葉中提取的查爾酮對小鼠肝癌細胞的影響。

Caspase為天冬氨酸特異性半朧氨酸蛋白水解酶，是一類可介導細胞凋亡的蛋白水解酶。Caspase的活性位點均包含半朧氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基後的膚鍵，從而造成細胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中重要的公共凋亡效應因子，其活化在細胞凋亡信號轉導過程中起核心作用，是細胞凋亡過程中激活的關鍵蛋白激酶和主要效應因子。大多數觸發細胞凋亡的因素，均需通過Caspase-3介導的信號傳導途徑導致細胞凋亡。當Caspase-3表達增多時，細胞凋亡加速。

本實驗結果顯示，AC40、20mg/kg劑量AC組瘤細胞Caspase-3的陽性表達率均高於陰性對照組，說明AC具有引發腫瘤細胞Caspase-3蛋白表達，促進瘤細胞凋亡的作用。該結果與文獻中報道的查爾酮具有抗腫瘤作用的結論相一致。

Bax是Bcl-2家族中重要一員，起促凋亡作用。Bax蛋白被激活後將會易位至線粒體外膜，發生寡聚體化，線粒體通透性轉變通道開放，線粒體內的細胞色素C進入細胞質，啓動線粒體依賴性的凋亡通路，使細胞發生凋亡。當Bax蛋白表達增多時，細胞凋亡加速。

本實驗結果中陰性對照組Bax蛋白的陽性表達率低於AC40、20mg/kg劑量組，說明AC可引發腫瘤細胞中Bax蛋白的表達，促進腫瘤細胞凋亡。該結果與前述Caspase-3蛋白表達相吻合。

細胞增殖活性是反映細胞生理狀態的基礎性指標。本實驗結果顯示，AC20、40mg/kg劑量組腫瘤細胞增殖活性明顯低於陰性對照組，說明AC對H22肝癌細胞增殖有一定抑製作用。

瘤質量是表示腫瘤發展狀態的重要指標。結果顯示，AC20、40mg/kg劑量組平均瘤質量均低於陰性對照組，提示AC具有抑制肝癌細胞生長的作用。兩項結果均與上述Caspase-3和Bax的測定結果相吻合。

綜上，明日葉查爾酮能降低小鼠H22肝癌細胞的增殖活性，提高Casepase-3和Bax蛋白表達水平，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用。