明日葉查爾酮對2型糖尿病大鼠肝臟和骨骼肌葡萄糖轉運體表達的影響

研究地點：青島大學醫學院公共衛生系，青島

摘   要

目的：

研究明日葉查爾酮對2型糖尿病大鼠肝臟葡萄糖轉運體2(Glut2)和骨骼肌葡萄糖轉運體4(Glut4)蛋白表達的影響。

方法：

製造2型糖尿病大鼠模型，隨機分成高、中、低劑量組和糖尿病對照組，分別每日灌胃給予30、10、5和0mg/kgBW明日葉查爾酮。各組以高脂飼料餵養4周後，用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖；放射免疫法檢測血清胰島素含量；免疫組化法檢測葡萄糖轉運體蛋白表達水平。

結果：

經圖像分析，高劑量組肝臟和骨骼肌葡萄糖轉運體蛋白表達平均光密度值分別為(0.036±0.0030)和(0.063±0.0139)，均較糖尿病對照組顯著升高(P＜0.05)。高劑量組空腹血糖和胰島素水平分別為(12.3±1.64)mmol/L和(25.65±3.34)μIU/ml，均較糖尿病對照組顯著性降低(P＜0.05)。

結論：

明日葉查爾酮可上調2型糖尿病大鼠肝臟葡萄糖轉運體2和骨骼肌葡萄糖轉運體4蛋白表達水平，降低空腹血糖和胰島素水平，改善糖尿病胰島素抵抗狀況。

關鍵詞：明日葉查爾酮；2型糖尿病；葡萄糖轉運體

 

明日葉(Angelicakeiskei)又名鹼草，原產於日本八丈諸島，屬傘形科多年生草本植物。查爾酮(chalcone)是一種含有1，3-二苯基丙烯酮結構的黃酮類化合物，是明日葉的主要活性成分，在明日葉的根、莖中含量較為豐富。有究表明，明日葉查爾酮(Angelicakeiskeichalcone，AC)具有抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學功效。

本實驗採用給2型糖尿病大鼠模型口服AC的方法，觀察了其對2型糖尿病大鼠肝臟和骨骼肌葡萄糖轉運體蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實驗動物和飼料清潔級健康雄性Wistar大鼠，許可證號：scxk(魯)20090007，體重(170±10)g，由山東魯抗醫藥實驗中心提供。實驗動物於本實驗室適應性餵養一周進行實驗。高脂飼料和普通飼料購自中國醫學科學院實驗動物研究所。

1.1.2明日葉查爾酮實驗樣品由青島某公司提供，採用有機溶劑浸提法提取，經紫外分光光度法測定，含量大於90%，查爾酮標準品由美國Sigma公司提供。

1.1.3試劑和儀器鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自sigma公司(批號：S0130)；胰島素放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所(批號：20111220)，葡萄糖轉運蛋白免疫組化試劑盒及兔抗鼠多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司(批號：lot999805w；lot909091w；862150Ainvitrogen)；血糖儀及試紙、顯微鏡、照相機均為OLYMPUS公司產品。

1.2實驗方法

1.2.12型糖尿病大鼠模型制備將實驗動物用高脂飼料餵養，4周後腹腔注射STZ。檢測空腹血糖，血糖值＞16.7mol/L者為造模成功。

1.2.2動物分組與處理將造模成功的糖尿病大鼠參照血糖隨機分成高、中、低查爾酮劑量組和糖尿病對照組，每組10只，均餵飼高脂飼料，分別每天經口灌胃給予明日葉查爾酮的劑量為30、10、5、0mg/kgBW，正常對照組為正常大鼠餵飼普通飼料，連續飼餵4周。空腹12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血並分離血清，取肝臟和股四頭肌標本，檢測各項指標。

1.3檢測指標

1.3.1肝臟Glut2和骨骼肌Glut4蛋白表達採用免疫組化法測定。分別取肝臟和股四頭肌標本，經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，脫水，阻斷滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，封閉，滴加一抗(肝臟標本Glut2兔抗鼠多克隆抗體，骨骼肌標本Glut4兔抗鼠多克隆抗體)和二抗，DAB反應染色，蘇木素復染，脫水，透明，乾燥，封片，高倍顯微鏡下隨機選取視野觀察Glut2和Glut4蛋白表達水平，並採用Image-ProPlus圖像軟件進行光密度分析，每只動物分析2個視野，各組的表達水平以平均光密度值表示。

1.3.2血清胰島素含量採用放射免疫法測定。取血清0.1ml，加入抗體、37℃溫育、加分離劑、室溫靜置、離心等處理後測定沈澱管的放射性計數。測定並依據放射性計數繪制log-logit標準曲線，計算出血清胰島素含量。

1.3.3血糖採用葡萄糖氧化酶法測定。尾尖取血滴於血糖儀配套試紙上，讀取血糖儀上顯示的數據。

1.4統計處理

採用SPSS18.0軟件對計量資料進行單因素方差分析後，採用Bonferroni法，以α=0.05為檢驗水準進行顯著性檢驗。

 

2結果

2.1Glut2蛋白表達水平Glut2蛋白主要表達於細胞質，呈棕黃色顆粒。本試驗肝臟Glut2蛋白呈現高劑量組陽性細胞數目多，染色深，為高度表達(圖1)。高劑量組與糖尿病對照組平均光密度值分別為(0.036±0.0030)和(0.014±0.0048)，差異有顯著性(P＜0.05)。各組Glut2蛋白表達平均光密度(MOD)值見表1。

2.2Glut4蛋白表達水平Glut4蛋白主要表達於細胞質，呈棕黃色顆粒。本試驗骨骼肌Glut4蛋白呈現高劑量組陽性細胞數目多，染色深，為高度表達(圖2)。高劑量組與糖尿病對照組平均光密度值分別為(0.063±0.0139)和(0.018±0.0087)，差異有顯著性(P＜0.05)。各組Glut4蛋白表達平均光密度(MOD)值見表1。

2.3空腹血糖與空腹胰島素含量與糖尿病對照組比較，高劑量組空腹血糖和空腹胰島素水平均降低，且差異有統計學意義(P＜0.05)。各組測量結果見表2。

3討論

有文獻報道明日葉查爾酮具有降低糖尿病氧化應激和血糖水平、改善胰島素抵抗等作用，也有學者研究發現，明日葉查爾酮可通過活化過氧化物酶體有活性的增殖子感受器-c表現出胰島素樣活性。

本次試驗結果可見，糖尿病對照組的空腹血糖和胰島素水平高於正常對照組，高劑量組的空腹血糖和胰島素水平則低於糖尿病對照組，表明明日葉查爾酮可降低2型糖尿病大鼠血糖和胰島素水平，改善胰島素抵抗。糖尿病的重要表現為胰島素抵抗，此時骨骼肌、肝臟和脂肪組織等外周組織對胰島素敏感性降低，葡萄糖的攝取、利用減少。在這些外周組織細胞中轉運葡萄糖的是葡萄糖轉運體。葡萄糖轉運體(Gluts)是一個蛋白家族，目前已經鑒定了14種亞型，每種在組織細胞中的表達及其動力學性質均不同。肝臟最主要的葡萄糖轉運體是Glut2，在肝細胞中Glut2與胰島素受體(IR)形成復合物而發揮作用。當Glut2表達和功能受影響時，可發生肝臟對葡萄糖攝取和利用不足，胰島素介導的糖代謝異常。

本次實驗結果表明，糖尿病對照組肝臟Glut2蛋白表達水平均較正常對照組顯著性降低，而高劑量組則均較糖尿病對照組顯著性升高，且呈現其作用隨劑量增加而增大的劑量效應關係，說明明日葉查爾酮可增加2型糖尿病大鼠肝臟Glut2蛋白的表達，進而增強葡萄糖由血液到肝細胞內的轉運和肝糖原合成，使血糖濃度降低。Glut4主要分布於骨骼肌細胞內，在餐後和運動時，Glut4轉運葡萄糖的速率大幅提高。Glut4為胰島素敏感的葡萄糖載體。胰島素與細胞外膜上的胰島素受體結合，經過一系列信號使細胞內含有Glut4的囊泡移動到細胞膜並與之融合，使膜表面Glut4含量猛增，大幅提高葡萄糖的轉運，維持血糖穩態。

本次實驗結果顯示，高劑量組骨骼肌Glut4蛋白表達水平較糖尿病對照組顯著性升高，表明明日葉查爾酮可提高2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut4蛋白的表達。綜合本次實驗結果可以認為，明日葉查爾酮可降低2型糖尿病大鼠血糖和血清胰島素水平，改善胰島素抵抗，其調節機制可能與明日葉查爾酮可上調肝臟Glut2和骨骼肌Glut4表達水平，從而增強了血液中葡萄糖向肝臟和骨骼肌細胞內轉運有關。