明日葉查爾酮對糖尿病大鼠肝細胞PI3K和AktmRNA表達的影響

研究地點：青島大學醫學院營養研究所，青島

摘    要

目的

研究明日葉查爾酮(ashitabechalcone，AC)對糖尿病大鼠肝細胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyIinositol3-kinase，PI3K)和蛋白激酶(serine-threoninekinases，Akt)mRNA表達的影響。

方法

高脂飼料餵養加鏈尿佐菌素腹腔注射誘發的2型糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組和高、低劑量AC組，每組10只，均餵飼高脂飼料，分別每日經口灌胃給予明日葉查爾酮0、30和10mg/kgBW。另設一個正常對照組為正常大鼠餵飼普通飼料，實驗週期4周。用放射免疫分析法檢測血清胰島素水平，葡萄糖氧化酶法測血糖含量，逆轉錄聚合酶鏈式反應方法檢測肝細胞PI3K和AktmRNA表達水平，蛋白印跡法測肝細胞Akt磷酸化水平。

結果

高劑量AC組空腹血糖和血清胰島素水平顯著低於糖尿病對照組，而PI3KmRNA、AktmRNA和磷酸化Akt蛋白表達水平均顯著高於糖尿病對照組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

結論

明日葉查爾酮可上調糖尿病大鼠PI3K和AktmRNA的表達水平，改善胰島素抵抗。

 

關鍵詞：明日葉查爾酮磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶Akt胰島素抵抗

 

PI3K/Akt信號通路是胰島素受體後信號轉導的關鍵途徑，是激活葡萄糖轉運體，促進糖原合成和葡萄糖轉運的關鍵效應分子。Akt磷酸化及PI3K與Akt表達降低，可導致胰島素受體後的信號轉導障礙，從而發生胰島素抵抗。明日葉是原產於日本八丈島的野生芹科植物，查爾酮(chalcone)是明日葉(Angelicakeiskei)的主要功效成分。

有研究報道，明日葉查爾酮(ashitabechalcone，AC)具有抗氧化、降血糖、改善胰島素抵抗等有良好生物活性。本研究給高脂飼料餵養+鏈尿佐菌素所致的糖尿病大鼠口服AC，探討了AC對糖尿病大鼠Akt磷酸化、PI3K和AktmRNA表達和胰島素抵抗的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物和飼料

清潔級健康雄性Wistar大鼠(山東魯抗醫藥實驗中心提供)，6～8周齡，體重180～200g，許可證號：SCXK(魯)2009-2007，合格證號：0013862，在本實驗室適應性餵養7d後用於實驗(動物房室溫25℃，相對濕度50%，光照度150lx)。高脂飼料(10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規飼料)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2實驗樣品

明日葉查爾酮由本實驗室制備，經紫外分光光度法測定含量＞90%。查爾酮標準品購於美國Sigma公司。

1.3試劑和儀器

鏈尿佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；血清胰島素放射免疫測定試劑盒，天津九鼎醫學生物工程有限公司；RNA抽提試劑盒，天根生化科技有限公司；兔InsR多克隆抗體，美國Neomarkers公司；SP試劑盒，邁新生物技術開發有限公司；DYY-7C型電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統，上海韻涵生物科技有限公司；紫外分光光度計UV-2000，龍尼柯儀器有限公司；台式高速冷凍離心機TGL-16，湘儀離心機公司。

1.4造模及分組

實驗動物在本實驗室適應性飼養1周後，隨機取10只設為正常對照組，飼以基礎飼料。其餘動物用高脂飼料餵養3周後，連續3d腹腔注射小劑量STZ(25mg/kg)，繼續高脂飼料餵養，一周後測定空腹血糖大於11.1mmol/L為造模成功大鼠。參照血糖水平將成模大鼠隨機分為糖尿病對照組和高、低劑量AC組，每組10只，均飼以高脂飼料。高、低劑量AC組分別每日經口灌胃給予明日葉查爾酮30、10mg/kg，正常對照組和糖尿病對照組則給予蒸餾水。實驗4周後，全部動物禁食12h後，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清檢測血糖和胰島素水平，取肝組織置－80℃冷凍備檢肝細胞PI3K和AktmRNA表達水平及肝細胞Akt磷酸化水平。

1.5空腹血糖和血清胰島素水平測定

血清胰島素水平用放射免疫分析法檢測，血糖含量用葡萄糖酶氧化法測定，並根據公式計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)：胰島素抵抗指數=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

1.6肝細胞PI3K和AktmRNA表達水平測定

取肝組織用Trizol試劑提取大鼠肝臟總RNA並測定純度後，在逆轉錄酶(MLV)催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。

磷脂酰肌醇3激酶基因上下游引物：

5′-AGCATCCCCTCCGTGCCCAA-3’和5′-GAAGGCGGGGGAGGGGAGAG-3’，擴增片段為333bp；

蛋白激酶B基因上下游引物：

5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3’和5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3’，擴增片段為361；

GAPDH為內參照，其上下游引物：

5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3’和5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3’，擴增片段為291bp。

所用引物均由上海生工生物公司合成。胰島素受體基因的擴增條件：預變性95℃，2min後，進入循環，95℃20s、59℃25s、72℃30s，45個循環後72℃延長5min。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置於MUVB．20凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描，以GADPH為內參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.7肝細胞磷酸化Akt蛋白表達測定

用Western-blot法檢測肝細胞磷酸化Akt表達。取肝組織100mg置於離心管中，加入RIPA900μl，冰浴勻漿後立即加入PMSF100μl，轉移至1.5ml離心管中加入Complete液40μl，40℃離心10000r/min，10min，取上清液紫外法測定蛋白含量後。取含30μg總蛋白的上清液進行12%SDS-PAGE電泳。停止電泳後於4×100V條件下轉膜1h，然後用脫脂奶粉37℃封閉1h，充分洗膜後加相應稀釋的一抗溶液(磷酸化Akt按1∶500稀釋、GADPH按1∶2000稀釋)4℃孵育過夜，洗膜後加入HRP酶標二抗，37℃與PVDF膜共同孵育雜交1h，洗膜後將雜交膜與感光膠片在暗室內曝光顯示各蛋白條帶，GAPDH蛋白表達量為內對照，用凝膠成像及分析系統分析各組蛋白顯色的密度值並計算各組Akt/GAPDH值。

1.8統計處理

實驗數據以x±s表示，採用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，並同時進行LSD比較，以P＜0.05為具有統計學意義。

 

2結果

2.1血糖、血清胰島素及HOMA-IR的比較

由表1可見，糖尿病對照組血糖、胰島素水平和HOMA-IR均高於正常對照組，高劑量AC組則低於糖尿病對照組，差異均有顯著性(P＜0.05)。

2.2各組PI3K和AktmRNA表達水平

由表2可見，糖尿病對照組的PI3K和AktmRNA表達水平均顯著低於正常對照組(P＜0.05)。高劑量AC組的PI3K和AktmRNA表達水平均高於糖尿病對照組，差異有顯著性(P＜0.05)。電泳圖譜見圖1。

2.3各組磷酸化Akt表達正常對照組和糖尿病對照組的Akt/GAPDH值分別為1.47±0.28和0.68±0.14。糖尿病對照組磷酸化Akt蛋白表達水平顯著低於正常對照組(P＜0.05)。AC高劑量組Akt/GAPDH值為1.34±0.26，高於糖尿病對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖2)。

3討論

本研究中糖尿病對照組的血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數均顯著性高於正常對照組(P＜0.05)，說明成功誘發了糖尿病大鼠模型，存在胰島素抵抗。AC高劑量組的血糖和血清胰島素水平均低於糖尿病對照組，說明AC可降低2型糖尿病血糖水平，改善胰島素抵抗。PI3K/Akt信號通路為胰島素受體通路的主要下游信號通路，其中PI3K、Akt是胰島素信號向調節葡萄糖轉運方向轉導的關鍵蛋白。PI3K是一類特異性的催化磷脂酰肌醇(PI)3位羥基磷酸化，產生具有第二信使作用的激酶。Akt是PI3K的下游分子，主要負責由PI3K始動的生物信息的轉導。磷酸化是Akt激活的主要機制，活化的Akt可促進糖原合成和葡萄糖轉運，是胰島素最終發揮效應的關鍵分子。

本研究結果顯示，糖尿病對照組PI3KmRNA、AktmRNA與Akt磷酸化水平均顯著低於正常對照組(P＜0.05)，說明存在胰島素信號轉導障礙。這與文獻報道的在高脂飼料餵養的ob/ob小鼠(2型糖尿病鼠)肝細胞中PI3K表達量和活性較正常低50%以及糖尿病SD大鼠骨骼肌Akt蛋白表達和磷酸化水平均降低相一致。

分析各AC組結果顯示，高劑量AC組PI3KmRNA、AktmRNA、磷酸化Akt水平明顯高於糖尿病對照組(P＜0.05)，而其血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數則顯著低於糖尿病對照組(P＜0.05)，並且高劑量組的改善作用顯著大於低劑量組，表明AC具有上調2型糖尿病大鼠的PI3KmRNA和Akt的mRNA與磷酸化表達水平，逆轉PI3K/Akt信號通路信號轉導障礙，改善2型糖尿病的胰島素抵抗作用。本結果與HIROMU等報道的結果相一致。