明日葉查爾酮對2型糖尿病大鼠胰島素受體表達的影響

摘  要

目的：探討明日葉查爾酮(Ashitabechalcone，AC)對2型糖尿病(2-DM)大鼠肝細胞及紅細胞胰島素受體表達的影響。

方法：將採用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)加高脂飼料飼養方法建立的Wistar大鼠2型糖尿病模型隨機分為4組：高、中、低劑量組，分別經口灌胃給予明日葉查爾酮30、10、5mg/(kg•bw)；糖尿病對照組給予等量生理鹽水灌胃，各組均餵以高脂飼料；正常對照組為正常大鼠餵以普通飼料。檢測肝臟和紅細胞胰島素受體表達及空腹血糖、血清胰島素等指標。

結果：與正常對照組比較，糖尿病對照組空腹血糖和血清胰島素水平顯著性升高，肝細胞胰島素受體表達和紅細胞胰島素受體結合位點r1和r2則均降低(P＜0.01)；高劑量組的血糖水平和血清胰島素水平均較糖尿病對照組降低，肝細胞胰島素受體表達和紅細胞胰島素受體結合位點r1和r2則升高(P＜0.01)，差異均有統計學意義。

結論：明日葉查爾酮可上調2型糖尿病大鼠肝組織和紅細胞胰島素受體表達水平，降低血糖和血清胰島素水平。

關鍵詞：明日葉查爾酮；2型糖尿病；胰島素受體

研究地點：山東青島，青島大學醫學院

明日葉(Angelicakeiskei)是一種原產於日本八丈諸島的傘形花科多年野生草本芹科植物。查爾酮是明日葉莖和葉子中黃色汁液的主要成分。有研究證明，明日葉查爾酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等多種生物活性。2型糖尿病的特徵性表現為胰島素抵抗，而受體數目減少和(或)功能異常與胰島素抵抗的發生有密切關係。本實驗給用Wistar大鼠制備的2型糖尿病模型飼以不同劑量的明日葉查爾酮，檢測肝細胞和紅細胞上胰島素受體的表達水平等指標，觀察明日葉查爾酮對2型糖尿病大鼠胰島素受體表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物與飼料健康清潔級雄性Wistar大鼠，60只，體重170±10g，由山東魯抗實驗中心提供。大鼠實驗前於本實驗室適應性餵養7d。動物的普通和高脂飼料，由中國醫學

院實驗動物研究所提供。

1.2主要材料

明日葉查爾酮，由青島海隆達公司提供，經紫外線分光光度法測定其純度＞90%；查爾酮標準品，購於美國Sigma公司，純度＞99%；鏈脲佐菌素STZ，購自美國Sigma公司；125-碘化鈉，美國杜邦公司生產，胰島素測定試劑及化學發光免疫測定儀，美國DP公司產品，UV-2000紫外分光光度計，尤尼柯儀器有限公司生產，羅氏全活力型血糖儀及配套試紙，德國羅氏公司產品。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備

將實驗動物用高脂飼料餵養4周，分別在第5周的1、3和5天早晨，各空腹腹腔注射STZ25mg/(kg•bw)、15mg/(kg•bw)、15mg/(kg•bw)1次，在末次注射後72h，尾尖取血檢測空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L者為造模成功。

1.3.2實驗分組

將制備的糖尿病大鼠組分為對照組和明日葉查爾酮高、中、低劑量組，每組10只，均餵飼高脂飼料，其中高、中、低劑量組分別經口灌胃給予明日葉查爾酮30、10、5mg/(kg•bw)，正常對照組為正常大鼠餵飼普通飼料，連續飼養4周。空腹12h尾尖採血測定血糖含量，以7%水合氯醛腹腔注射麻醉，取肝臟組織，腹主動脈採血8mL並分為抗凝和不抗凝兩種處理進行指標檢測。

1.4檢測指標

1.4.1空腹血糖測定

葡萄糖氧化酶法，取微量尾尖血滴於羅康全活力型血糖儀配套試紙上，讀取血漿血糖數值。

1.4.2血清胰島素測定用放射免疫法測定，取血清0.1mL加入沈澱管中，經加入標記物抗體、37℃溫育、分離劑、離心等處理後測定沈澱管的放射性計數。根據標準管及非特異性管放射性計數繪制log-logit標準曲線，計算血清胰島素的含量。

1.4.3肝細胞胰島素受體蛋白表達測定

應用免疫組化方法測定，將取得的肝組織經過4%甲醛固定，進行石蠟包埋，切片，SABC免疫組化法反應，進行DAB顯色，脫水，透明，封片；進行高倍鏡觀察和利用Image-ProPlus圖像軟件進行光密度分析。

1.4.4紅細胞胰島素受體測定

採用放射性配體結合分析試劑盒測定；用白細胞分離液(33.9%泛影葡胺和9%Fickll液按1∶2.4體積比混合)將白細胞從全血中除去後，計數紅細胞懸液的紅細胞數。受體測定反應體系中包括INS標準品50μL，A14-［125I］-單碘INS50μL和紅細胞懸液200μL，INS標準品濃度依次為0、1、5、20、80、320、1280ng/mL，液體混勻後固定於振蕩器，15℃孵育20h，加入緩衝液及分離劑混勻，離心，棄上清，測定下層細胞的放射性。經Scatchard作圖分析求算出高親和力、低親和力受體結合容量q1、q2，以q1、q2除以相應的紅細胞數量即為每個紅細胞的胰島素受體數目r1、r2。1.5統計處理採用SPSS17.0軟件進行統計分析，各試驗組與對照組採用單因素方差分析，組間比較採用SNK-q法。檢驗水準α=0.05。

2結果與分析

2.1血糖、胰島素含量和紅細胞數

與正常對照組比較，糖尿病對照組空腹血糖和胰島素含量升高(P＜0.01)，與糖尿病對照組比較，高劑量組空腹血糖和胰島素含量降低(P＜0.01)，差異均具有統計學意義。各組的血糖、胰島素和紅細胞測定結果見表1。

2.2肝細胞胰島素受體表達

肝細胞胰島素受體為細胞膜表達，陽性表達呈現橙黃色顆粒。附圖顯示，糖尿病對照組呈現陽性表達的細胞數量較正常對照組少，染色淺，為低表達；高劑量組較糖尿病對照組陽性表達的細胞數量多，染色深，表達水平升高。

經光密度分析，高劑量組與糖尿病對照組的平均光密度值分別為0.402±0.006和0.375±0.010(P＜0.01)，差異有統計學意義；正常對照組為0.448±0.008，與糖尿病對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。各組大鼠肝臟IR蛋白表達的平均光密度值見表2。

2.3紅細胞胰島素受體的表達水平

糖尿病對照組紅細胞的高、低親和力受體結合位點數r1和r2分別為64.73±0.34、1827.05±55.54，均低於正常對照組(P＜0.01)；與糖尿病對照組比較，高劑量組r1和r2分別為80.23±0.47、2205.72±67.12，差異均具有統計學意義(P＜0.01)；各組測定見表3。

3討論

胰島素受體是一種跨膜蛋白廣泛存在多種組織器官上，其中肝臟是胰島素受體的典型靶器官。肝細胞胰島素受體對機體葡萄糖的代謝有重要影響作用。紅細胞雖然不是胰島素的靶細胞，但紅細胞膜上胰島素受體數量的增減與其它細胞呈一致關係，對表明組織細胞的葡萄糖代謝利用有較好的代表性。紅細胞上胰島素受體分為高親和力和低親和力兩種，高親和力胰島素受體結合位點r1數目較少，但可以特異性與胰島素結合迅速發揮作用；低親和力胰島素受體結合位點r2與胰島素結合容量大，反應持久，可反映胰島素受體的儲備能力；有報道，糖尿病患者可能同時伴有胰島素受體數目減少及結合能力下降。

本實驗結果顯示，糖尿病對照組空腹血糖和空腹胰島素水平明顯高於正常對照組，表明成功制備2型糖尿病大鼠模型；高劑量組的空腹血糖和空腹胰島素水平低於糖尿病對照組，說明補充明日葉查爾酮可降低2型糖尿病大鼠空腹血糖和胰島素水平，改善其胰島素抵抗和糖代謝。

本實驗肝臟和紅細胞上胰島素受體表達水平結果可見，糖尿病對照組的肝細胞胰島素受體蛋白表達水平及紅細胞的胰島素受體結合位點均低於正常對照組，表明2型糖尿病存在由胰島素受體數目的減少，胰島素敏感性下降而引起的胰島素抵抗。

實驗結果還可見，高劑量組的肝臟和紅細胞上胰島素受體的表達水平明顯高於糖尿病對照組，並且高劑量組表達水平高於中劑量組和低劑量組，說明補充明日葉查爾酮可以增加2型糖尿病大鼠胰島素受體表達、增強胰島素的敏感性，從而降低血糖和血清胰島素水平。本項結果與文獻報道黃酮類化合物能夠通過增加靶細胞島素受體表達改善胰島素的敏感性，使受體環節的胰島素信號傳導障礙減輕相符合。

綜上可以認為，明日葉查爾酮後能提高2型糖尿病大鼠高肝臟和紅細胞胰島素受體表達水平，降低空腹血糖和血清胰島素，改善2型糖尿病的胰島素抵抗和糖代謝。