摘要
目的：研究不同明日葉查耳酮成分對人肝癌細胞SMMC-772l增殖的抑製作用。
方法：以人胃癌細胞株MGC-803為研究對象，通過MTT法觀察不同時間點明日葉中查爾酮成分對細胞增殖的影響，經Hoechst33258和AO/EB染色，再通過螢光顯微鏡觀察其細胞核形態變化。結果：MTT實驗結果顯示化合物1、2、6、7、9和10，對人肝癌細胞SMMC-7721均有較強的抑製作用，並且顯示出明顯的劑量依賴關係。隨藥物濃度的增加，細胞增殖抑製作用明顯加強。
結論：明日葉中查耳酮類成分有抑制SMMC-7721細胞增殖的作用。
關鍵詞：明日葉；查耳酮；4-羥基德里辛（4HD）；黃腐醇（XA）；MTT；細胞凋亡
本實驗主要同大阪藥科大學馬場貴美江學術團隊合作，以人胃癌細胞株MGC-803為研究對象，通過MTT法觀察不同時間點明日葉中查爾酮成分對細胞增殖的影響；通過倒置顯微鏡觀察明日葉中查爾酮成分對胃癌細胞一般的外觀形態：經Hoechst33258和AO/EB染色，再通過螢光顯微鏡觀察其細胞核形態變化：通過透視電子顯微鏡觀察其細胞的超微結構變化，瓊脂糖凝膠電泳觀察細胞DNA的ladder；流式細胞術進行細胞凋亡率的測定和細胞週期分析。以期探討明日葉中查爾酮成分在體外是否通過誘導細胞凋亡來抑制癌細胞的增殖，為其更好地運用於胃癌的治療提供實驗依據。
1材料與儀器
1.1藥物與試劑
RPMll640培養基（GIBCO，美國）；新生牛血清（日本）（56℃水浴滅活0.5h）；胰酶（AMRESCO，美國）；MTT（AMRESCO，美國）；青霉素、鏈霉素（日本寶生公司）；0.1mmol/L磷酸鹽緩衝液（PBS，pH7.2～7.4）自制；二甲基亞碸（DMSO，AMRESCO）；其他為國產分析純試劑。
實驗所用查爾酮樣品均由日本大阪藥科大學實驗室從明日葉中分離所得，經熔點測定、UV、1H-NMR和13C-NMR等確定結構，HPLC測定其純度均大於99.40%。
化合物分別為：①Xanthoangelol，②4-Hydroxyderricin，③isobavachalcone，④xanthoangelolB，⑤xanthoangelolC，⑥xanthoangelolD，⑦xanthoangelolE，⑧xanthoangelolF，⑨xanthoangelolG，⑩xanthoangelolH。
1.2
細胞株及細胞培養
人胃癌細胞株MGC-803購自南京建成生物技術發展有限公司。選用含10%小牛血清的DMEM培養液。
細胞培養條件：於37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱常規培養，待細胞滿至80%左右時，用0.25%胰酶消化、傳代。選用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液，培養液中青霉素、鏈霉素的的濃度為100mg•L-1。
1.3主要儀器
CO2細胞培養箱（SANYON，日本）；酶標分光光度讀板儀（Bio-Rad680，USA）；精密電子分析天平（BP211D，Startorius）；超淨工作台（蘇州淨化設備廠）；OLYMPUS倒置顯微鏡（Japan）；WH-861型旋渦混合器（江蘇省太倉市科教器材）；離心機（JingLiLDS-10B）；恆溫水浴鍋（華利達HS-6），96孔細胞培養板（Cosuar）等儀器。
2方法
2.1樣品處理
實驗所用藥物查耳酮全部由大阪藥科大學實驗室制備，經HPLC分析，其純度高於95%。以二甲基亞碸（DMSO）助溶，DMSO最終濃度不超過1.0%。
0.22μm微孔濾膜（GVMP01230，Millipore，USA）過濾除菌，4℃保存待用。
2.2MTT比色法
MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沈積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。取處於對數生長期的細胞，用0.5%的胰酶消化，吹打成單細胞懸液，接種於96孔板中（細胞密6×104cells/ml），每孔98μl。在細胞貼壁並生長融合至50%～70%加藥處理，每種藥物設5個濃度梯度（每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液，平面混勻後，置於培養箱中繼續孵育4h，然後棄去各孔中的上清液，再加入100μLDMSO，平面振蕩混勻10min，待其各孔中的紫色結晶完全溶解後，置於酶標分光光度讀板儀下測定各孔中的吸光值（A，λ490nm）。按下面公式計算細胞活率：
細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%
其作用時間分別設為24h、36h、48h與72h，待藥物作用時間結束，利用MTT法觀察藥物對細胞增殖的影響。
注：（A）（B）圖中所示化合物 a、b、c、…g；分別對應化合物①、②、③…⑦。（C）圖中所示化合物 h、i、j 分別對應化合物⑧、⑨、⑩（n=4）。
2.3結果
由圖1、2MTT實驗結果顯示化合物①、②、⑥、⑦與⑨和⑩對人肝癌細胞SMMC-7721均有較強的抑製作用，並且顯示出明顯的劑量依賴關係。隨藥物濃度的增加，細胞增殖抑製作用明顯加強。在高劑量20μg/mL時，藥物對細胞的抑製作用分別為68.18%、66.07%、56.69%、66.69%、45.76%與62.34%。
根據以上結果，認為查爾酮化合物①、②、⑥、⑦、⑨與⑩為有效抗腫瘤成分。
注：藥物作用時間分別為24h（◇），36h（■），48h（△）與 72h（▲）。
由圖3可知，藥物作用細胞24h、36h、48h與72h後，可明顯抑制細胞增殖，並且該製作用呈一定的劑量依賴性與時間依賴性。藥物在48h時的IC50值為5.98μg/ml。鑒於藥物抑制細胞增殖的作用可通過抑制細胞生長或者引導細胞凋亡來實現。為此，我們將進一步研究查耳酮類化合物能引導細胞凋亡，並且初步將藥物的作用時間定為48h。
3討論
目前研究認為，腫瘤的發生和發展不僅是腫瘤細胞增殖和分化異常所致，而且還是腫瘤細胞凋亡異常的結果。因此，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，對臨床治療腫瘤有指導意義。
本實驗結果表明：明日葉查耳酮在高劑量20μg/ml作用72h，SMMC-7721細胞形態變化明顯，細胞存活率顯著降低，提示氧化苦參鹼對SMMC-7721細胞的生長有抑製作用，且這種抑製作用呈時間劑量依賴性。
但也有研究認為，查耳酮作用於SMMC-7721細胞，使細胞堆積於s期。查耳酮是否作用於細胞核DNA，通過改變DNA序列和抑制DNA的合成而抑制腫瘤細胞的生長，值得進一步探討。
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