明日葉查爾酮對2型糖尿病大鼠肝細胞胰島素受體與胰島素受體底物-2mRNA表達的影響

科研機構：青島大學醫學院營養研究所、青島市疾病預防控制中心

摘  要

目的：

研究明日葉查爾酮（Ashitabechalcone,AC）對糖尿病大鼠肝細胞胰島素受體（insulinreceptor,InsR）和胰島素受體底物-2（insulinreceptorsubstrate-2,IRS-2）mRNA表達的影響。

方法：

將用高脂飼料餵養加鏈尿佐菌素腹腔注射誘發的2型糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組和高、低劑量AC組，每組10只,均餵飼高脂飼料,分別每日經口灌胃給予明日葉查爾酮的劑量為0、30、10mg/kg。另設一個正常對照組為正常大鼠餵飼普通飼料，實驗週期4周。

用放射免疫分析法檢測血清胰島素水平、逆轉錄聚合酶鏈式反應方法檢測肝細胞InsR和IRS-2mRNA表達水平、免疫組化法測肝細胞InsR蛋白表達水平、葡萄糖氧化酶法測血糖含量。

結果：

與正常對照組比較，糖尿病對照組空腹血糖和血清胰島素升高，而InsR和IRS-2mRNA表達水平降低。與糖尿病組比較，高劑量AC組空腹血糖和血清胰島素降低，而InsR和IRS-2mRNA表達水平升高，各項差異均有顯著性意義（P<0.05）。

結論：

明日葉查爾酮可上調2型糖尿病大鼠肝細胞InsR和IRS-2mRNA表達水平，改善胰島素抵抗狀況。

關鍵詞：明日葉；查爾酮；胰島素受體；胰島素受體底物-2；胰島素抵抗

正文：

明日葉(Angelicakeiskei)是原產於日本八丈島的野生芹科植物，明日葉查爾酮(Ashitabechalcone，AC)是明日葉中主要有效成分。明日葉查爾酮有良好的抗氧化、抗糖尿病等作用。

近來研究發現，2型糖尿病胰島素信號轉導障礙是發生胰島素抵抗的重要原因，胰島素受體(insulinreceptor，InsR)和胰島素受體底物-2(insulinreceptorsubstrate-2，IRS-2)是胰島素信號傳導通路中的關鍵分子。

為了探討AC對胰島素抵抗的影響及其可能的分子機制。本研究採用給2型糖尿病大鼠口服AC的方法，觀察了AC對肝細胞InsR和IRS-2mRNA表達的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物和飼料

清潔級健康雄性Wista大鼠45只(山東魯抗醫藥實驗中心提供)，6～8w齡，體重180～200g。高脂飼料由北京華阜康生物科技公司提供。

1.1.2實驗樣品

明日葉查爾酮由本實驗室制備，經紫外分光光度法測定含量＞90%。查爾酮標準品購於美國SIGMA公司。

1.1.3試劑和儀器

鏈尿佐菌素（STZ）：美國Sigma公司產品；血清胰島素放射免疫測定試劑盒：天津九鼎醫學生物工程公司提供；RNA抽提試劑盒：天根生化科技公司產品；兔InsR多克隆抗體：美國Neomarkers公司產品；SP試劑盒：邁新生物技術開發公司生產；DYY-7C型電泳儀：北京六一儀器廠生產；凝膠成像系統：上海韻涵生物科技公司產品；紫外分光光度計UV-2000：龍尼柯儀器公司；台式高速冷凍離心機TGL-16：湘儀離心機公司產品。

1.2方法

1.2.1造模及分組

動物在本實驗室適應性飼養1周後，隨機取10只設為正常對照組，其餘用高脂飼料餵養加腹腔注射STZ誘發糖尿病，測空腹血糖大於11.1mmol/L為造模成功。參照血糖水平將成模大鼠隨機分為糖尿病對照組和高、低劑量AC組，每組10只，均飼以高脂飼料。高、低劑量AC組分別每日經口灌胃給予明日葉查爾酮30、10mg/kg。正常對照組飼以基礎飼料。實驗4周後，全部動物禁食12h後，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清和取肝組織進行指標檢測。

1.2.2檢測指標

（1）空腹血糖、血清胰島素水平及胰島素抵抗指數；血清胰島素檢測：放射免疫分析法；血糖含量測定：葡萄糖酶氧化法。

胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=空腹胰島素×空腹血糖/22.5

（2）肝細胞InsR和IRS-2mRNA表達水平：將肝組織按Trizol試劑試劑盒說明書提取肝臟總RNA，用紫外可見分光光度儀測定其純度和含量。在逆轉錄酶(MLV)催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。胰島素受體基因上下游引物序列為5′-CCGAGAGCT-GGGGCAGGGAT-3’5′-GTAGGGGGAGGACGGCCTGG-3’，擴增片段為318bp；胰島素受體底物-2基因上下游引物為5′-GCCTTCGTGCCCACCCACTC-3’5′-AA-GGGGCTGCGCTGATGCTG-3’，擴增片段為346；GAPDH為內參照，其上下游引物為5′-TCTCCGCCCCTT-CCGCTGAT-3’5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3’，擴增片段為291bp。所用引物均由上海生工生物公司合成。胰島素受體基因的擴增條件：預變性95℃,2min後，進入循環，95℃，20s，59℃，25s，72℃，30s，45個循環後72℃延長5min。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置於MUVB.20凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描，以GADPH為內參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量；

（3）肝細胞InsR蛋白表達水平：用免疫組化法測定：取肝組織，經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片（3μm）；3%H2O2室溫孵育10min；5%～10%正常山羊血清封閉10～15min；加入一抗，37℃孵育1～2h；滴加二抗，37℃下10min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈卵白素，37℃下10min；DAB顯色，室溫3min；蘇木素復染1min；酒精脫水，中性樹膠封片等處理，進行拍照和圖像分析系統結果分析。

1.2.3統計處理

採用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，並同時進行LSD比較，以P＜0.05為有統計學差異。

2結果

2.1血糖、血胰島素及HOMA-IR（表1）

糖尿病對照組血糖、胰島素水平和HOMA-IR均高於正常對照組，高劑量AC組則低於糖尿病組,差別均有顯著性意義（P＜0.05）。

2.2InsR和IRS-2mRNA表達水平（表2，圖1）

糖尿病對照組的InsR和IRS-2mRNA表達水平分別為0.214±0.051和0.251±0.013，均較正常對照組顯著性降低（P＜0.05）。高、低劑量AC組的InsR和IRS-2mRNA表達水平均較糖尿病對照組提高，差異有顯著性（P＜0.05）。

2.3肝細胞InsR蛋白的表達水平（表3，圖2）

InsR蛋白為細胞膜表達，免疫組化染色後，呈現棕黃色物質為陽性。糖尿病對照組染色較對照組減弱，高劑量AC組較糖尿病組明顯增強（圖2）。各組圖像分析的平均積分光密度值（IDP）見表3。

3討論

2型糖尿病的主要特徵是存在血糖和血清胰島素水平都升高的胰島素抵抗及胰腺β細胞分泌功能異常,其原因與胰島素的受體結合及受體後信號轉導異常有密切關係。胰島素受體（InsR）與胰島素受體底物-2（IRS-2）是肝臟胰島素信號轉導過程中關鍵分子。IRS-2是胰島素受體底物（IRS）蛋白家族中的主要成員和胰島素信號核心介子，主要在肝臟和胰島β細胞中表達，具有促進肝糖原合成和抑制肝糖輸出的代謝效應。有研究發現，敲除IRS-2的小鼠，可出現外周胰島素抵抗和肝臟胰島素抵抗。也有學者報道肝臟IRS-2含量增加可使胰島素的生物學效應增強和胰島素敏感性增強。

本研究表明，糖尿病對照組血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數均較正常對照組顯著升高，而IRS-2mRNA和InsR的mRNA與蛋白表達水平則均較正常對照組顯著性降低，說明成功誘發2型糖尿病大鼠模型，存在胰島素抵抗和胰島素信號轉導障礙。胰島素信號通路中關鍵分子表達降低、磷酸化水平下降都可引起胰島素信號轉導障礙。高劑量AC組IRS-2mRNA和InsR的mRNA與蛋白表達水平均較糖尿病對照組顯著增高，而其血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數則均較糖尿病對照組顯著降低，且呈現出高劑量組的改善作用大於低劑量組的趨勢，表明AC有上調2型糖尿病大鼠的IRS-2mRNA和InsR的mRNA與蛋白表達水平，改善胰島素受體及受體底物的信號轉導，減輕2型糖尿病的胰島素抵抗的作用。

本研究顯示，明日葉查尓酮（Ashitabechalcone,AC）對2型糖尿病葡萄糖代謝的改善作用可能是通過改善胰島素信號轉導障礙，從而提高胰島素敏感性而實現的。本研究結果與文獻報道AC有降低糖尿病氧化應激和血糖水平，改善胰島素抵抗等作用相一致，為AC及相關植物化學物的抗糖尿病作用與機制研究提供新資料和依據。