明日葉查爾酮對小鼠H22肝癌細胞增殖活性的抑製作用研究

摘要:

為研究明日葉查爾酮(AC)對小鼠H 22肝癌細胞增殖的抑製作用，採用如下方法進行實驗:1)將50只荷H 22肝癌小鼠隨機分為5組，每組10只。低、中、高劑量組每日分別灌胃給予5、20和40mg·kg- 1明日葉查爾酮，腫瘤對照組給予生理鹽水，環磷酰胺(CTX)組隔天腹腔注射20mg·kg- 1的CTX。飼養10d後處死小鼠，測定瘤重、體重和抑瘤率，取瘤組織用免疫組化法檢測腫瘤細胞PCNA和Caspase-3蛋白的表達。 2)將不同濃度AC與小鼠H 22肝癌細胞共同培養，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定肝癌細胞增殖活性。結果為:1)腫瘤對照組的瘤重、PCNA和Caspase-3的陽性表達率分別為(0.55± 0.23)g、72.77%和5%，高劑量組則分別為(0.31± 0.05)g、28.33%和38.52%。 2)腫瘤對照組和高劑量組的細胞增殖活性分別為1.135± 0.032和0.716± 0.028。兩組間各項差別均有顯著性意義(p< 0.05)。從以上數據可以得出結論:明日葉查爾酮對小鼠H 22肝癌細胞的增殖有抑製作用。

 

關鍵詞：明日葉查爾酮， 肝癌， Caspase-3， PCNA

 

研究地點：

1.青島大學醫學院公共衛生學系，青島

2.山東省煙台護士學校，煙台

 

明日葉(Ashitaba)是一種原產於日本八丈諸島的芹科植物，島民多食用明日葉均很長，故又名長壽草。據報道，明日葉的主要功效成分查爾酮(chalcone)具有提高機體免疫力、潤腸通便、抗腫瘤和抗氧化等顯著功效。鄧良利等對明日葉的毒性及其致突變和致畸性進行了研究，結果顯示明日葉的急性毒性為實際無毒級，致突變試驗陰性，傳統致畸試驗中未見發育毒性。

 

國外對於明日葉的研究較多，大量學者研究證實明日葉是一種藥食兩用的保健食品，可殺死白血病細胞，治療糖尿病並具有消炎殺菌的作用。由此可見，明日葉是一種綠色無毒健康的植物，發展前景廣闊，具有深遠的研究價值。

 

細胞增殖與凋亡的失衡是腫瘤發生發展的基礎，細胞的過度增生而凋亡的減少是腫瘤生長的主要因素。目前尚未見有關於明日葉查爾酮對腫瘤細胞增殖與凋亡影響的研究報道。本實驗通過給荷H 22肝癌瘤小鼠餵飼不同劑量的明日葉查爾酮(Ashitabachalcone，AC)和將H 22肝癌細胞與AC共同培養的方法，檢測腫瘤重量、細胞Caspase-3和PCNA表達和腫瘤細胞增殖活性等指標，探討了AC對H 22肝癌細胞的抑製作用。

 

1　材料與方法(Materialsandmethods)

1.1　主要材料

1.1.1　實驗動物

H 22肝癌荷瘤種鼠由山東省實驗動物中心提供。清潔級健康昆明種小鼠50只(雌雄各半)，由山東魯抗醫藥實驗中心提供，6- 8周齡，體重18- 20g。小鼠實驗前於本實驗室適應性餵養7d。

1.1.2　實驗樣品

明日葉查爾酮由本實驗室制備，經紫外分光光度法測定其純度> 90%。查爾酮標準品購於美國Sigma公司。

1.1.3　試劑與儀器

RPM 1640培養基、胎牛血清和四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國GIBCO公司)；環磷酰胺(10013021)(江蘇恆瑞醫藥股份有限公司)；PCNA、Caspase-3一抗、二抗和即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；5%CO2培養箱(日本三洋電器有限公司)；TDL-5離心機(上海安亭科學儀器廠)；酶標儀(瑞典產RosysAnthos雙波長2010型)；倒置顯微鏡(日本產OlympusXDS-1B型)。

 

1.2　實驗方法

1.2.1　動物實驗

1.2.1.1　腫瘤接種　無菌抽取H 22肝癌小鼠腹水，鏡下調節腫瘤細胞密度至1× 107mL- 1，製成細胞懸液於小鼠右前肢腋窩處皮下接種，每只0.2mL。

1.2.1.2　動物分組與處理　腫瘤細胞接種後次日，將50只小鼠隨機分為腫瘤對照組、環磷酰胺組和低、中、高3個明日葉查爾酮劑量組，每組10只，雌雄各半。 3個AC劑量組分別經口灌胃給予明日葉查爾酮5、20和40mg·kg- 1，連續10d。腫瘤對照組同樣方法給予生理鹽水，環磷酰胺組隔日腹腔注射CTX(20mg·kg- 1)1次。於第11天頸椎脫臼處死全部小鼠，取瘤組織待檢。

1.2.1.3　瘤重、體重和瘤體比　採用電子動物天平測量動物的瘤重和體重，計算瘤重/體重的比值。

1.2.1.4　瘤細胞Caspase-3和PCNA蛋白表達採用SABC免疫組化法，按檢測試劑盒說明檢測。將瘤組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，3%H2O2消除內源性過氧化物酶，微波修復抗原。按1:50

濃度滴加一抗， 4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，脫水，透明和封片。顯微鏡下觀察PCNA和Caspase-3蛋白的表達水平。每只動物觀察500個細胞，記錄其中有陽性表達的細胞數。陽性表達率=(陽性細胞數/計數細胞總數)× 100%

 

1.3　體外瘤細胞增殖活性測定

取H 22小鼠肝癌組織剪碎研磨，經過濾和離心後製成瘤細胞懸液。調節細胞密度為1× 106mL- 1，接種於96孔培養板，每孔100μL。高、中和低劑量組的AC終濃度依次為5、25和50mg·L- 1，腫瘤對照組只加等體積緩衝液，CTX組加入CTX 20mg·

L- 1。置於5%CO2培養箱中37℃培養16h，用MTT法測定各孔吸光度。各組腫瘤細胞增殖活性用平均吸光度(A值)表示，並按公式:抑制率=(腫瘤對照組A值-實驗組A值)/腫瘤對照組A值× 100%計算各AC組對小鼠肝癌細胞增殖活性的抑制率。

1.4　統計分析

採用SPSS 17.0統計軟件，計數資料做x2檢驗，計量資料做單因素方差分析。

 

2　結果(Results)

2.1　瘤重、體重和瘤體比

正常對照組未見腫瘤發生。腫瘤對照組及高劑量組的平均瘤重分別為(0.55± 0.23)g和(0.31± 0.05)g，差異具有統計學意義(p< 0.05)。其他各組結果見表1。

 

2.2　Caspase-3和PCNA蛋白表達

Caspase-3陽性表達細胞的胞漿中出現棕黃色或褐色顆粒。本實驗腫瘤對照組陽性表達的細胞數少且顏色淺淡，呈弱表達(圖1A)。AC高劑量組Caspase-3陽性表達細胞數多且顏色較深，呈強表達(圖1B)。兩組陽性細胞表達率分別為5%和38.52%，差異具有顯著性(p< 0.05)。

PCNA為胞核表達，呈棕黃色或褐色顆粒。本實驗腫瘤對照組PCNA陽性表達的細胞多，染色深(圖2A)。AC高劑量組較腫瘤對照組的陽性表達細胞數少，染色淺(圖2B)。

兩組陽性細胞表達率分別為26.11%和35.76%，差異具有顯著性(p < 0. 05)。各組Caspase-3及PCNA表達結果見表2。

 

2.3　腫瘤細胞增殖活性

高、中劑量AC組腫瘤細胞增殖活性分別為0.716± 0.028和0.834± 0.027，均較腫瘤對照組顯著性降低(p< 0.05)。各組細胞增殖活性測定結果見表3。

 

3　討論(Discussion)

明日葉查爾酮屬黃酮類化合物，是明日葉的主要功效成分，其化學結構為1，3-二苯基丙烯酮，是植物體內合成黃酮的前體，以它為母體的天然化合物廣泛存在於植物界中。有研究證明，從甘草中提取的查爾酮具有抗腫瘤和抗氧化等功效[8-10]，因此本實驗探討了從明日葉中提取的查爾酮對小鼠H 22肝癌細胞增殖的抑製作用，為明日葉在癌症治療方面的應用提供理論依據。

Caspase全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，是一組存在於細胞質中具有類似結構的蛋白酶。它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性地切割靶蛋白天冬氨酸殘基後的肽鍵，從而造成細胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的公共凋亡效應因子，其活化在細胞凋亡信號轉導過程中起核心作用，是細胞凋亡過程中激活的關鍵蛋白激酶和主要效應因子[11]。大多數觸發細胞凋亡的因素，均需通過Caspase-3介導的信號傳導途徑導致細胞凋亡[12]。當Caspase-3表達增多時，細胞凋亡加速。本實驗結果顯示，高、中劑量AC組瘤細胞Caspase-3的陽性表達率高於腫瘤對照組，這說明AC具有引發腫瘤細胞Caspase-3蛋白表達，促進瘤細胞凋亡的作用。該結果與文獻中報道的查爾酮具有抗腫瘤作用的結論一致[8]。

增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶delta的輔助蛋白，其合成、表達與細胞的增殖密切相關，是反映細胞增殖水平的重要指標[13]。當細胞的增殖活性升高時，PCNA表達增強，PCNA增殖指數升高，PCNA表達減弱，PCNA增殖指數降低，表示細胞增殖活性降低[14]。本實驗結果顯示，高、中劑量查爾酮組PCNA蛋白陽性表達率較腫瘤對照組顯著降低，且高劑量組低於中劑量組，這表明查爾酮具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。

細胞增殖活性是反映細胞生理狀態的基礎性指標[15]。MTT法是檢測細胞增殖活性最常用的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原外源性MTT為水不溶於水的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沈積在細胞中，結晶生成量與細胞的代謝活性密切相關[16-17]。當細胞受損或死亡時，該反應降低或消失，說明細胞增殖活性下降。本實驗結果顯示，中、高劑量AC組腫瘤細胞增殖活性明顯低於腫瘤對照組，這說明AC對H 22肝癌細胞增殖有一定抑製作用。本項結果也與上述Caspase-3和PCNA的測定結果吻合。

綜合本次實驗結果可以認為，明日葉查耳酮能降低小鼠H 22肝癌細胞的增殖活性和PCNA蛋白表達水平，使Casepase-3蛋白表達增強，對小鼠H 22肝癌細胞增殖活性具有一定抑製作用。