研究地點：1. 青島大學醫學院公共衛生學院，山東青島； 2. 青島市市立醫院，山東青島
摘 要
目的
研究明日葉查爾酮對小鼠急性輻射損傷的防護作用。
方法
將50 只昆明種小鼠隨機分5 組，每組10 只。低、中和高劑量組每天灌胃給予明日葉查爾酮4、20 和40 mg /kg，輻射損傷組與正常對照組給予生理鹽水，連續5 d，
第6 天給予一次性X 射線全身照射4Gy，空白對照組不照射。照射後按前述方法繼續灌胃5 d 處死動物，檢測體重、骨髓嗜多染紅細胞微核率，脾淋巴細胞增值活性與肝細胞凋亡等指標。
結果
與正常對照組比較，輻射損傷組的體重、淋巴細胞增殖活性和Bcl-2 /Bax 值降低，而高劑量組則較輻射損傷組升高； 輻射損傷組的微核率高於正常對照組和高劑量組。上述各組的差異均有統計學意義( P ＜ 0. 05) 。
結論
明日葉查爾酮對小鼠X 射線所致輻射損傷有一定防護作用。
【關鍵詞】明日葉查爾酮； 微核； 細胞增殖； 細胞凋亡； Bcl-2 /Bax
明日葉( Angelica keiskei Koidzumi，又名八丈芹、濱海當歸) 是一種多年生芹科植物，其主要效應成分為查爾酮( chalcone) ［1］。查爾酮是植物體內合成黃酮的前體物質，其基本骨架結構為1，3-二苯基丙烯酮。
有研究證明，明日葉查爾酮具有抗腫瘤、提高機體免疫力、抗氧化、清除自由基等多種生物學活性［2］。本實驗採用給輻射損傷小鼠經口灌胃給與明日葉查爾酮的方法，測定實驗動物體重，骨髓嗜多染紅細胞微核率，細胞增殖與凋亡等指標，對明日葉查爾酮的抗輻射損傷作用進行了實驗研究。
1. 材料與方法
1. 1 實驗動物
清潔級健康昆明種小鼠50 只，雌雄各半，體重22 ～ 25 g，由山東魯抗醫藥實驗中心提供，許可證號: SCXK( 魯) 20080002，在本實驗室適應性餵養1 周後進行實驗。
1. 2 主要儀器
美國Varian 公司生產的2100 C 型6MV 直線加速器X 射線源； 瑞典產Ｒosys Anthos 2010型雙波長酶標儀； Q-911 全自動放免儀，中國科技大學實業總公司； XDS-1B 型倒置顯微鏡、DP72 型圖像採集設備，日本Olympus 公司。
1. 3 主要試劑
ＲPM1640 培養基、胎牛血清、小牛血清、四甲基偶氮唑藍( MTT) 均購自美國Gibco 公司；Giemsa 染液購自於南京建成生物工程研究所； Bcl-2和Bax 一抗、二抗和即用型SABC 免疫組化試劑盒均購自於武漢博士德生物工程有限公司。
1. 4 動物分組與處理
將50 只昆明種小鼠隨機分為正常對照組、輻射損傷組、明日葉查爾酮( AC) 低、中、高劑量組共5 組，每組10 只，雌雄各半。低、中、高劑量組每日經口灌胃給予劑量為每日4、20 和40 mg /kg·BW 明日葉查爾酮，正常對照組與輻射損傷組給予生理鹽水，連續5 d。在第6 天實驗動物進行X射線一次性全身照射，照射距離為1. 1 m，輻射劑量為4 Gy，正常對照組不照射。各組小鼠均按前述方法分別給予明日葉查爾酮和生理鹽水5 d，第6 天脫臼處死，取組織待檢。
1. 5 檢測指標
1. 5. 1 小鼠體重:
各組小鼠在實驗第1 天、輻照前1 d、輻照後1 d 和輻照後第6 天的早晨各稱重1 次。
1. 5. 2 骨髓嗜多染紅細胞微核率:
取股骨用2 ml 小牛血清將骨髓沖洗至離心管中，1 000 r /min 離心，按常規方法棄上清液、制備細胞懸液、製片、固定、染色和顯微鏡觀察。每只動物觀察1 000 個骨髓嗜多染紅細胞，記錄其中的微核細胞數並計算微核率。
1. 5. 3 脾淋巴細胞增值活性:
將無菌取出的脾臟經研磨、過濾、離心等處理後，用含10% 胎牛血清的1640培養基製成脾淋巴細胞懸液，調細胞密度至1 × 106個/ml，接種於96 孔板，每孔0. 1 ml，每只動物設5 個平行孔。37 ℃、5% CO2培養箱培養20 h，每孔加入5 mg /ml的MTT 20 μl，繼續培養4 h 棄去培養液，加入二甲基亞碸( DMSO) 後避光震蕩2 min，用酶標儀在492 nm 波長下檢測溶液的吸光度( A) ，各組細胞增殖活性用平均吸光值表示。
1. 5. 4 肝組織Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白表達水平:
免疫組化法測定，取肝臟經固定、脫水、透明處理、包埋後製成組織切片，將切片進行脫蠟和水化、滅活內源性酶、熱修復和封閉處理後滴加一抗和二抗，DAB 顯色，再經蘇木素復染，在高倍鏡視野( × 400) 下觀和拍照，用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行光密度分析。
1. 6 統計學方法
採用SPSS 17. 0 統計軟件，計量資料做單因素方差分析，以P ＜ 0. 05 為差異有統計學意義。
2 結果
2. 1 小鼠體重
照射後第1 天和第6 天，輻射損傷組的小鼠體重均較正常對照組顯著性降低( P ＜ 0. 05) ，中、高劑量組則較輻射損傷組顯著性增高( P ＜ 0. 05) ，各組實驗結果見表1。
| 表1 不同照射時間各組小鼠體重的測定結果( x平均 ± s ) | ||||
| 組別 | 實驗第1 天 | 輻射前1 天 | 輻射後1 天 | 輻射後6 天 |
| 正常對照組 | 21. 058 ± 1. 901 | 24. 295 ± 1. 089 | 24. 361 ± 1. 358 | 26. 93 ± 0. 857 |
| 輻射損傷組 | 21. 160 ± 1. 876 | 24. 440 ± 0. 655 | 22. 883 ± 1. 252ab | 22. 778 ± 0. 829ab |
| 低劑量組 | 22. 640 ± 2. 403 | 24. 155 ± 1. 179 | 23. 323 ± 1. 272 | 24. 178 ± 0. 807 |
| 中劑量組 | 21. 801 ± 2. 334 | 24. 330 ± 1. 332 | 24. 396 ± 1. 388 | 24. 792 ± 0. 919 |
| 高劑量組 | 21. 801 ± 1. 334 | 24. 382 ± 0. 989 | 24. 375 ± 1. 247 | 25. 578 ± 0. 916 |
| 注: 與正常對照組相比較，a P ＜0. 05； 與中、高劑量組比較，b P ＜0. 05； n =10。 | ||||
2. 2 骨髓嗜多染紅細胞( PCE) 微核率
輻射損傷組微核率高於正常對照組，高劑量組則較輻射損傷組降低，差異均有統計學意義( P ＜ 0. 05 ) ，各組結果見表2。
| 表2 各組小鼠微核率和脾淋巴細胞增殖活性的實驗結果( x平均 ± s) | ||
| 組別 | 微核率 | 增值活性 |
| 正常對照組 | 3. 534 ± 0. 179 | 0. 534 ± 0. 179 |
| 輻射損傷組 | 18. 912 ± 0. 525ab | 0. 179 ± 0. 025ab |
| 低劑量組 | 18. 792 ± 0. 288b | 0. 179 ± 0. 028b |
| 中劑量組 | 13. 638 ± 0. 644 | 0. 358 ± 0. 144 |
| 高劑量組 | 8. 667 ± 0. 543 | 0. 607 ± 0. 031 |
| 注: 與正常對照組相比較，a P ＜ 0. 05； 與高劑量組比較，b P ＜ 0. 05； n = 10。 | ||
2. 3 脾淋巴細胞增值活性
正常對照組和輻射損傷組脾淋巴細胞增值活性分別為0. 534 ± 0. 179 和0. 179± 0. 025，二者差異有統計學意義( P ＜ 0. 05) 。高劑量組較輻射損傷組顯著性升高( P ＜ 0. 05) ，各組結果見表2。
2. 4 肝細胞Bax 和Bcl-2 蛋白
Bcl-2 和Bax 陽性表達在胞漿內為橙黃色顆粒，染色越深表示表達越強。與輻射損傷組比較，高劑量組的Bcl-2 陽性表達的細胞多、染色深，呈強表達； Bax 則陽性表達的細胞少、染色淺，呈弱表達( 圖1) 。圖像分析結果顯示，高劑量組Bcl-2 為76. 975 ± 1. 847，較輻射損傷組顯著性升高( P ＜ 0. 05) ； Bax 為48. 782 ± 0. 929，較輻射損傷組顯著性降低( P ＜ 0. 05) ，各組Bcl-2 和Bax 蛋白，以及Bcl-2 /Bax 結果見表3。
| 表3 各組Bax 蛋和Bcl-2 蛋白及Bcl-2/Bax 比值實驗結果( x平均 ± s) | |||
| 組別 | Bax | Bcl-2 | Bcl-2 /Bax比值 |
| 正常對照組 | 41. 295 ± 1. 089 | 82. 361 ± 1. 958 | 1. 993 ± 0. 057 |
| 輻射損傷組 | 72. 440 ± 0. 455ab | 56. 383 ± 2. 282ab | 0. 778 ± 0. 029ab |
| 低劑量組 | 69. 155 ± 1. 979b | 60. 723 ± 1. 672b | 0. 878 ± 0. 007b |
| 中劑量組 | 61. 430 ± 1. 332 | 67. 096 ± 1. 588 | 1. 092 ± 0. 019 |
| 高劑量組 | 48. 782 ± 0. 929 | 76. 975 ± 1. 847 | 1. 578 ± 0. 016 |
| 注: 與正常對照組相比較，a P ＜ 0. 05； 與高劑量組比較，b P ＜ 0. 05； n = 10。 | |||
3 討論
隨著科技的發展和具有放射性物質的應用，人類接觸各種電磁輻射的機會增加，受到輻射損傷的危險性也隨之增加。X 射線屬電磁輻射中的電離輻射，通過水在輻解反應中產生的自由基引起機體損傷［3］，對電離輻射較為敏感的器官大多為骨髓、肝臟、脾臟等DNA 合成旺盛的組織器官，受到輻射後可誘發DNA、染色體等生物大分子損傷。因此對輻射的防護已經成為關注的焦點。
小鼠骨髓嗜多染紅細胞微覈實驗是檢測染色體損傷的一種有效方法［4］。骨髓對輻照較為敏感，骨髓細胞受到輻射損傷可導致紡錘絲受損，在有絲分裂時被留在胞質內的染色體斷片形成微核( micronuclei)［5］，微核率的高低反映了輻射對機體損傷的程度。
本實驗結果證明，輻射損傷組骨髓嗜多染紅細胞微核率較正常對照組升高，中、高劑量組均較輻射損傷組顯著性降低，說明明日葉查爾酮對X 射線誘發的骨髓嗜多染紅細胞微核的升高有一定的抑製作用。細胞增殖活性水平是反映細胞生命力強弱的一個重要指標［6］。MTT 法是檢測細胞增殖活性常用的方法［7］。
本實驗結果顯示，與正常對照組比較，輻射損傷組細胞增殖活性降低，3 個劑量組較輻射損傷組均較輻射損傷組升高，並且存在劑量－ 反應關係，提示明日葉查爾酮對X 射線引起的脾淋巴細胞增殖活性的損傷有一定的防護作用。Bcl-2 基因家族及其相關蛋白bcl-2 是目前頗受重視的調控細胞凋亡的基因［8］。Bcl-2 蛋白高表達可抑制細胞凋亡，Bax 蛋白過表達可使細胞趨於凋亡［9］。兩者的比值決定了細胞對凋亡信號敏感性，Bcl-2 /Bax升高呈現出抑制細胞凋亡作用［10］。
本實驗結果可見，輻射損傷組Bcl-2 /Bax 比值較正常對照組降低，3個劑量組較輻射損傷組均較輻射損傷組升高，並存在隨明日葉查爾酮劑量增加Bcl-2 /Bax 比值逐漸升高的劑量－ 反應關係，說明明日葉查爾酮對X 射線引起的細胞凋亡水平升高有一定抑製作用。本項結果與上述細胞增殖活性和骨髓嗜多染紅細胞微核的實驗結果相吻合，也與文獻報道明日葉查爾酮具有抗氧化清除自由基的結果相一致［11］。
本次實驗的小鼠體重結果顯示，照射後第1 天和第6 天，輻射損傷組小鼠體重均較正常對照組顯著性降低，而中、高劑量組則高於輻射損傷組，表明明日葉查爾酮對X 射線誘發的小樹體重降低有一定的防護作用。
總之，本次實驗結果表明明日葉查爾酮可抑制X射線引起的小鼠體重下降、骨髓嗜多染紅細胞微核率升高、脾淋巴細胞增殖活性降低和肝細胞凋亡水平增加，提示明日葉查爾酮對電離輻射引起的急性輻射損傷有一定的防護作用。
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