研究地點：
- 上海交通大學農業與生物學院，陸伯勳食品安全研究中心，上海
- 貴陽護理職業學院，貴州貴陽
- 上海交通大學醫學院，上海
摘 要
研究目的及方法：
以明日葉莖桿與葉子為研究對象，在測定其乙醇提取物總酚酸及總黃酮含量的基礎上，以蘆丁為陽性對照，測定其乙醇提取物總抗氧化能力，鐵離子還原/抗氧化力，以及對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH有機自由基的清除作用，並對莖桿與葉子乙醇提取物進行抗氧化活性比較。
結果表明：
葉乙醇提取物總酚酸和總黃酮的含量分別是莖乙醇提取物的2.2倍和5.2倍。在總黃酮質量濃度相同的條件下，葉乙醇提取物和莖乙醇提取物的抗氧化活性均與其總黃酮質量濃度呈正相關，且葉乙醇提取物的抗氧化性大於莖乙醇提取物。與蘆丁相比較，蘆丁對羥基自由基的清除能力大於葉乙醇提取物，其他抗氧化活性均小於葉乙醇提取物而大於莖乙醇提取物。
結果表明，明日葉的葉乙醇提取物可以作為一種新型有效的天然抗氧化物質進行開發利用。
關鍵詞：明日葉，總酚酸，總黃酮，抗氧化活性，清除率
明日葉(AngelicakeiskeiKoidzumi)原產於日本八丈島，屬傘形科當歸2年生或多年生草本植物，島上居民多食用明日葉，均很長壽，因此又名長壽菜、八丈芹、海峰人參等。明日葉含多種天然活性物質，營養豐富均衡，作為一種藥食兼用的蔬菜備受關注，現今在韓國、台灣以及我國海南、雲南、山東等地已廣泛種植。近年來的一些研究報道表明，明日葉富含黃酮類物質，具有增強免疫力、防癌抗癌、降血脂、抗糖尿病、抗炎消炎等功效。目前國內明日葉總黃酮提取工藝和檢測方法已有文獻報道，對明日葉不同組織部位如莖桿與葉子抗氧化活性組分含量測定分析以及抗氧化性比較研究鮮有報道。
本實驗測定明日葉莖和葉乙醇浸提物主要抗氧化成分總酚酸和總黃酮的含量，並分析了其抗氧化活性。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
明日葉（上海交通大學農業與生物學院種植實驗基地）。T-AOC測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測試盒(南京建成生物工程研究所)；原兒茶酸（上海源葉生物科技有限公司）；福林酚試劑（海荔達生物科技有限公司）；蘆丁標準品（純度＞98%，上海融禾醫藥科技有限公司）；無水乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、NaHCO3、FeSO4等，均為分析純。
1.2 儀器與設備
RT-25粉碎機(北京興時利和科技發展有限公司)；DK-S26電熱恆溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；EPPENDOF5810R離心機(上海肯強儀器有限公司)；DU800uv/vis分光光度計(美國Beck-manCoulter公司)；旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠)；FD-1A-50冷凍乾燥機(北京博醫康實驗儀器公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 明日葉莖與葉乙醇提取物的制備
明日葉用水洗淨，置於－20℃冷凍24h，然後冷凍乾燥22h，得到脫水明日葉。將脫水明日葉莖桿和葉子分開，分別制備乙醇提取物。明日葉莖和葉分別採用超低溫液氮粉碎的方法粉碎，並過100目篩，得到乾燥粉末。按質量體積比1∶10(g∶mL)將乾燥粉與體積分數為65%的乙醇溶液混合，45℃水浴加熱15min浸提，浸提液在4℃，8000r/min離心20min，取上清液置於圓底燒瓶中，在42℃、0.1MPa下進行旋轉蒸餾去除乙醇，剩餘浸提液冷凍乾燥，得到莖和葉乙醇提取物粉末(抗氧化活性分析樣品，簡稱樣品)。
1.3.2 明日葉莖和葉乙醇提取物中抗氧化活性組分的含量測定
1.3.2.1 總酚酸含量測定
總酚酸含量測定採用Folin-Ciocalteu法。原兒茶酸標準曲線製作：準確秤取原兒茶酸10mg，用體積分數為95%乙醇溶解，配成200μg/mL原兒茶酸標準液。準確取原兒茶酸標準液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mL分別置於25mL容量瓶中，用乙醇稀釋定容。將1.5mL福林試劑分別加到1mL以上不同濃度原兒茶酸溶液中，混勻靜置5min，然後加3mLNa2CO3溶液(10g/100mL)，混勻，在50℃的水浴中加熱5min，室溫下避光靜置2h，以試劑空白作參比，在760nm波長下測定吸光度A。以原兒茶酸質量濃度c(μg/mL)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程A=0.0983c，R2=0.9932。
總酚酸含量測定：取5mg樣品，用體積分數65%乙醇溶解，定量轉移至50mL容量瓶，配成100μg/mL待測液備用。取1mL待測液，按標準曲線建立的方法測定吸光度A，根據(1)式求出樣品液總酚酸含量。
式中：c為標準曲線回歸方程計算出的總酚酸質量濃度(μg/mL)；1.00為加入待測液體積(mL)；V1總酚酸測定反應體系總體積(mL)；V2為待測液總體積(mL)；m為樣品質量(g)。
1.3.2.2 總黃酮含量測定
總黃酮含量測定採用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法。蘆丁標準曲線繪制：準確取蘆丁標準溶液(0.2mg/mL)0.00、0.20、0.40、0.60、1.00、1.20mL，分別置於10mL容量瓶中，加入質量分數5%NaNO20.4mL，搖勻，放置6min，再加入質量分數10%Al(NO3)30.4mL，搖勻，放置6min，再加入質量分數5%NaOH4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白作為參比，在510nm處測定吸光度Y，以蘆丁質量濃度X(mg/mL)為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到蘆丁吸光度與濃度的標準曲線回歸方程Y=6.7558X－0.0036，R2=0.9942。
總黃酮含量測定：取0.01g樣品，用體積分數65%乙醇溶解，定量轉移至10mL容量瓶，配成1mg/mL待測液備用。取1mL待測液液，按標準曲線建立的方法測定吸光度，計算樣品液總黃酮含量。
式中：c1為樣品的總黃酮質量濃度(mg/mL)；Va顯色反應總體積(mL)；Vb為樣品待測液體積(mL)；1.00為顯色反應加入樣品溶液體積(mL)；m為樣品質量(g)。
1.3.3 總抗氧化能力測定
取10g明日葉的葉片乙醇浸提物粉，用體積分數65%乙醇溶解，配250mL溶液，測定其吸光度為2.901，根據蘆丁標準曲線回歸方程換算葉樣液總黃酮質量濃度為4.27mg/mL。取15g明日葉的莖乙醇浸提物粉，同樣方法配成100mL溶液，測得其吸光度為2.110，莖樣液總黃酮質量濃度為3.17mg/mL。將上述2種樣液準確稀釋為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL不同濃度溶液，以蘆丁為對照樣，採用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒法測定樣品總抗氧化能力。抗氧化物質能使Fe3+還原成Fe2+，後者可與菲啉類物質形成穩定的絡合物，通過比色可測出抗氧化能力的大小。具體操作參照南京建成生物工程研究所提供的總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒說明書。
單位定義：在37℃時，每分鐘每毫升被測液使反應體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為1個總抗氧化能力單位(U/mL)。根據(3)式求出樣品總抗氧化能力。
1.3.4 鐵離子還原法(FRAP)測定抗氧化活性
FRAP工作液配制(現用現配)：用300mmol/LpH3.6的醋酸鹽緩衝液，10mmol/LTPTZ溶液(40mmol/LHCl配制)，20mmol/LFeCl3·6H20溶液按10∶1∶1體積比配制而成。
FeSO4標準曲線的繪制：分別取濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的FeSO4溶液各0.5mL，加入4.5mLFRAP工作液，混勻後，37℃水浴反應10min，超純水調零，在593nm處測定其吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
樣品的抗氧化活性(FRAP值)以達到相同吸光度所需Fe-SO4的毫摩爾數表示。樣品抗氧化活性的測定：將葉、莖2種樣液準確稀釋為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5mg/mL溶液，用繪制FeSO4標準曲線同樣方法測定不同濃度樣品吸光度，應用標準曲線換算出FRAP值。蘆丁為對照樣。
1.3.5 超氧陰離子的清除能力測定
模擬機體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應系統，產生超氧陰離子自由基O2－·，加入電子傳遞物質及gress氏顯色劑，使反應體系呈現紫紅色。將葉、莖2種樣液準確稀釋為0.1、0.3、0.5、0.8、1.0mg/mL溶液，以蘆丁為對照樣，採用抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測定試劑盒測定法測定吸光度，根據(4)式求出樣品超氧陰離子的清除能力。具體操作參照南京建成生物工程研究所提供的抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書。
在反應系統中，每升樣液在37℃反應40min所抑制的超氧陰離子自由基相當1mg的Vc所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為1個活力單位(U/L)。
1.3.6 DPPH自由基的清除能力測定
取2mL0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL不同濃度樣液，分別加入2mL0.04mg/mL的DPPH溶液，混合均勻，暗處放置30min，在波長517nm處測其吸光度為Ai，取2mL上述濃度的樣液，各加入2mL無水乙醇，相同條件下測其吸光度為Aj，2mL無水乙醇與2mL0.04mg/mL的DPPH溶液混合均勻，相同條件下測其吸光度為AC。根據(5)式求出樣品DPPH自由基的清除能力。
其中：Ai，加抗氧劑時DPPH溶液的吸光度；Aj，樣液在測定波長時的吸光度；Ac，未加抗氧劑時DP-PH溶液的吸光度。
1.3.7 羥基自由基的清除能力測定
取2mL0.1、0.2、0.5、0.8、1.0mg/mL不同濃度樣液，各加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/LH2O2，靜置10min，再加2mL6mmol/L水楊酸混勻，37℃水浴反應20min，510nm處測其吸光度為Ai。同樣方法，雙蒸水代替水楊酸測得吸光度為Aj，雙蒸水代替樣液測得吸光度為Ac。據(6)式求出樣品對羥基自由基的清除能力。
2 結果與分析
2.1 明日葉莖與葉乙醇提取物抗氧化成分含量分析
現已證明很多疾病的發生與發展與自由基對組織細胞的損壞有密切的關係。植物來源的酚酸類化合物和黃酮類化合物都具有良好的抗氧化性。由表1可知，明日葉莖和葉乙醇提取物總酚酸含量和總黃酮含量都比較高，但葉子中含量更高，其總酚酸含量和總黃酮含量分別是莖的2.2倍和5.2倍。
| 表1 明日葉莖與葉乙醇提取物總酚酸和總黃酮含量
Table 1 Contents of total phennolic and total flavonoids of leaves and stem ethanol extracts from Angelica keiskei Koidzmi |
||
| 明日葉部位 | 總酚酸含量/% | 總黃酮含量/% |
| 葉 | 12. 36 ± 0. 18 | 10. 18 ± 0. 23 |
| 莖 | 5. 59 ± 0. 021 | 1. 96 ± 0. 018 |
2.2 明日葉莖與葉乙醇提取物總抗氧化能力分析
由圖1可知，明日葉莖與葉乙醇提取物總抗氧化能力較強，均強於具有抗氧化活性的標準物質蘆丁。總黃酮含量與總抗氧化能力呈正相關，並在葉和莖乙醇提取物總黃酮質量濃度相同的條件下，葉的總抗氧化性大於莖。黃酮結構複雜，種類繁多，不同結構黃酮抗氧化能力也不同。明日葉葉所含的總黃酮種類和莖可能不完全相同，所以在總黃酮質量濃度相同條件下，兩者抗氧化性有所不同。
2.3 明日葉莖與葉乙醇提取物鐵離子還原/抗氧化力分析
FRAP法測定抗氧化活性的原理是：TPTZ(Fe3+-三吡啶三吖嗪)可被樣品中的還原物質還原為二價鐵形式，呈現出藍色，並在590nm處具有最大吸收峰。根據吸光度大小計算抗氧化活性強弱。
按1.3.4方法得到標準品FeSO4標準曲線的回歸方程為：Y=2.0109x+0.1136(R2=0.9883)。明日葉莖與葉乙醇提取物FRAP值見圖2。由圖2可知，FRAP值與明日葉莖、葉乙醇浸提物總黃酮質量濃度成正相關。在總黃酮質量濃度相同的情況下，明日葉葉乙醇提取物抗氧化性強於莖乙醇提取物。與蘆丁相比，抗氧化性能力大小順序為明日葉葉乙醇提取物＞蘆丁＞明日葉莖乙醇提取物。
2.4 明日葉莖與葉乙醇提取物清除超氧陰離子能力分析
自由基是指獨立帶有不成對價電子的原子、分子、離子或化學基團。生物體內常見的自由基是氧自由基，其中超陰離子氧自由基O2－·形成最早，黃酮對不同的氧自由基的作用機理不同，對O2－·的作用機理是阻止自由基的引發。由圖3可知，明日葉莖與葉乙醇提取物有較強清除超氧陰離子能力，其總黃酮質量濃度與清除O2－·的清除率成正相關。在總黃酮含量相同的情況下，明日葉葉乙醇提取物清除率大於莖乙醇提取物。與蘆丁相比，清除率大小順序為明日葉葉乙醇提取物＞蘆丁＞明日葉莖乙醇提取物。
2.5 明日葉莖與葉乙醇提取物清除羥基自由基能力分析
羥基自由基是氧自由基中危害最大的，黃酮對羥基自由基的作用機理與對O2－·的作用機理不一樣，它是與金屬離子螯合阻止羥基自由基生成。由圖4可知，明日葉莖與葉乙醇提取物有較強清除羥基自由基能力，其總黃酮質量濃度與清除羥基自由基的清除率成正相關。總黃酮濃度相同的條件下，葉乙醇提取物對羥基自由基清除率大於莖乙醇提取物。與蘆丁相比，清除率大小順序為蘆丁＞明日葉葉乙醇提取物＞明日葉莖乙醇提取物。
2.6 明日葉莖與葉乙醇提取物清除DPPH自由基能力分析
DPPH是一種穩定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有最大吸收峰。當DPPH溶液中加入自由基清除劑時，孤對電子被配對，顏色由紫色變向黃色，吸光度發生變化。吸光度變化程度與清除自由基能力呈定量關係，所以可用分光光度法進行定量測定。由圖5可知，明日葉莖與葉乙醇提取物對DPPH自由基清除能力較強，總黃酮質量濃度相同的條件下，葉乙醇提取物對DPPH·清除率大於莖乙醇提取物，與蘆丁相比較，清除率大小順序為明日葉葉乙醇提取物＞蘆丁＞明日葉莖乙醇提取物。
3 結論
(1)明日葉的葉、莖乙醇提取物總酚酸和總黃酮含量分別為12.36%、5.59%和10.18%、1.96%，結果說明明日葉葉子組織部分比其莖桿部分含有更高的植物抗氧化活性物質。
(2)明日葉的葉乙醇提取物和莖乙醇提取物的抗氧化活性均與其總黃酮質量濃度呈正相關，在總黃酮質量濃度相同的條件下，葉乙醇提取物的抗氧化性大於莖乙醇提取物，與蘆丁相比，除了清除羥基自由基能力蘆丁強於明日葉葉，其餘方面的抗氧化性明日葉的葉乙醇提取物要強於蘆丁，這個研究結果表明作為抗氧化產品開發，明日葉葉乙醇提取物更具有開發利用價值。
發佈留言