研究地點：
- 貴陽護理職業學院，貴州貴陽 550081
- 上海交通大學農業與生物學院陸伯勳食品安全研究中心，上海 200240
摘 要
目的及方法：
為了研究明日葉黃酮類化合物對羥基自由基的清除作用，以明日葉（主要取葉片）為原料，用體積分數為65%乙醇提取明日葉總黃酮，測定其總黃酮含量。通過Fenton反應體系產生羥基自由基，利用明日葉提取液中的功能成分黃酮類化合物對羥基自由基的清除作用進行研究。
結果表明：
明日葉提取物總黃酮質量分數為10.18%，且黃酮類化合物對羥基自由基有較強清除效力，當提取物總黃酮濃度在0.1～1.0mg/mL範圍內，其與清除率呈正相關。明日葉中黃酮類化合物對羥基自由基有較強清除效力，作為天然抗氧化產品開發具有一定價值。
關鍵詞：明日葉；總黃酮；羥基自由基；清除率
明日葉（AngelicakeiskeiKoidzumi）原產於日本八丈島，又名八丈草。明日葉具有強韌的生命力，今日摘明日又長出牙，因而由產地及生長特徵而得名。明日葉富含黃酮類物質，具有增強免疫力、防癌抗癌、降血脂、治療糖尿病、抗炎消炎等功效。在生命活動的氧化代謝產物中會不斷產生各種含氧自由基，而自由基被認為是引起人體衰老和某些慢性疾病發生的原因之一，其中羥基自由基作用最強。黃酮類物質具有良好的抗氧化性，對羥基自由基具有明顯的清除作用。本實驗研究明日葉總黃酮對羥基自由基的清除能力。
1實驗
1.1材料與試劑
明日葉，產自上海交通大學農業與生物學院種植實驗基地；蘆丁標準品，純度＞98%，上海融禾醫藥科技有限公司產品；無水乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硫酸亞鐵等，均為分析純。
1.2儀器與設備
RT-25粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；DK-S26電熱恆溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；EPPENDOF5810R離心機（上海肯強儀器有限公司）；DU800UV/Vis分光光度計（美國BeckmanCoulter公司）；旋轉蒸發器（上海青浦滬西儀器廠）；FD-1A-50冷凍乾燥機（北京博醫康實驗儀器公司）。
1.3實驗方法
1.3.1明日葉總黃酮浸提物的制備
明日葉用水洗淨，置於－20℃冷凍24h，然後冷凍乾燥22h，得到脫水明日葉。採用超低溫液氮粉碎的方法將明日葉粉碎，並過100目篩，得到乾燥粉末。按質量體積比為1∶10的比例將乾燥粉與體積分數為65%的乙醇溶液混合，在45℃水浴加熱15min浸提，浸提液在4℃、8000r/min條件下離心20min，取上清液置於圓底燒瓶中，在42℃、0.1MPa條件下進行旋轉蒸餾去除乙醇，將剩餘浸提液冷凍乾燥，得到明日葉總黃酮浸提物粉末作為樣品。
1.3.2明日葉總黃酮含量的測定
明日葉浸提物總黃酮含量測定採用硝酸鋁―亞硝酸鈉比色法，具體操作方法主要是參考文獻10，得到蘆丁吸光度與質量濃度的標準曲線回歸方程y＝0.0068x－0.0035，R2＝0.9942。蘆丁質量濃度在0～25μg/mL範圍內呈現良好的線性關係。明日葉浸提物總黃酮含量測定：取0.01g樣品，用體積分數65%乙醇溶解，定量轉移至10mL容量瓶，配成1mg/mL待測液備用。取1mL待測液液，按標準曲線建立的方法測定吸光度，根據（1）式求出樣品液總黃酮質量分數。
式中ρ為標準曲線回歸方程計算出的總黃酮質量濃度（μg/mL），Va為顯色反應總體積（mL），Vb為樣品待測液體積（mL），1.00為顯色反應加入樣品溶液的體積（mL），m為樣品質量（g）。
1.3.3明日葉總黃酮對羥基自由基的清除能力的測定
採用Fenton反應產生羥基自由基：H2O2＋Fe2+→OH－＋·OH＋Fe3+，水楊酸能有效捕捉羥基自由基且反應生成有色產物，其有色產物在510nm處有較強吸收峰。當在體系中加入黃酮類物質，由於黃酮具有清除羥基自由基能力，體系顏色發生變化，因此可用分光光度法測定黃酮類物質對羥基自由基的清除率。由於黃酮在510nm處有較強吸收峰，Fe2+可以與水楊酸形成有一定顏色的絡合物，從而對測定水楊酸與羥基自由基反應生成的有色產物產生影響。因此以硫酸亞鐵、水楊酸以及不同濃度的樣液混合物為本底吸收，測定本底吸光度，在計算中扣除。
E為羥基自由基的清除率；Ai為加抗氧劑時溶液的吸光度；Aj為本底吸光度；Ac為未加抗氧劑時溶液的吸光度。
1.3.3.1Ac值的測定取2mL雙蒸水，加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/LH2O2，靜置10min，再加2mL6mmol/L的水楊酸混勻，在37℃水浴反應20min，於510nm處測其吸光度Ac。
1.3.3.2Ai值的測定
分別取2mL不同濃度的樣液，各加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/L的H2O2溶液，靜置10min後加2mL6mmol/L的水楊酸混勻，在37℃水浴反應20min，於510nm處測其吸光度Ai。
1.3.3.3Aj值的測定
分別取2mL不同濃度的樣液，各加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/L水楊酸溶液，靜置10min後加2mL雙蒸水混勻，在37℃水浴反應20min，於510nm處測其吸光度為Aj。
2結果與分析
2.1明日葉總黃酮含量
表1為明日葉總黃酮質量分數的測定結果。由表1可知，明日葉提取物總黃酮的平均質量分數為（10.18±0.23）%。
2.2明日葉總黃酮對羥基自由基的清除能力
表2為明日葉總黃酮對羥基自由基清除能力的測定結果。由表2可知，提取液總黃酮質量濃度在0.1～1.0mg/mL範圍內時清除率與提取液濃度呈正相關；當提取液總黃酮濃度達到1.0mg/mL時，清除率達到61.9%；當提取液總黃酮質量濃度＞1.0mg/mL時，總體趨勢是清除率隨著提取濃度增大而增大，但不呈正相關，原因是當提取液總黃酮濃度增大，混合樣液本底吸光度會受到干擾增大，規律性就會受到一定的影響。
3結論
明日葉乙醇提取物總黃酮質量分數為10.18%。結果說明明日葉含有較高天然植物抗氧化活性物質。明日葉總黃酮對羥基自由基具有較強的清除能力，提取液總黃酮質量濃度在0.1～1.0mg/mL範圍內清除率與濃度呈正相關，總黃酮質量濃度達到1.0mg/mL時，清除率為61.9%。結果表明明日葉黃酮類物質具有較強抗氧化能力，可作進一步抗氧化性研究和天然抗氧化產品的開發。
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